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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】外源基因在293T细胞的表达
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】外源基因在293T细胞的表达

有一段2400bp片段插入pcDNA3.1载体——酶切、PCR和测序验证是正确的；转染进293T细胞——同时转染GFP质粒，效率达90%以上证明操作没有问题；但是48小时和36小时候裂解蛋白,western没有结果；今天更是提取总RNA，反转录，PCR，证明是有目的基因的。为什么不表达呢？
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1楼 2011-02-21 21:07:28
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-02-21 22:16:55
wuw579(金币+1): 好像应该做一个 但是没有纯蛋白 2011-02-22 11:33:47

你确认抗体是ok的？做过阳性对照没
其次，有没有移码？
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2楼2011-02-21 22:09:59
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tigertang

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+6): 谢谢热心解答~ 2011-02-22 08:48:29
wuw579(金币+2): 谢谢 2011-02-22 11:34:51

1. 如果带tag，确认同框；如果N端不带tag，建议在ATG前加ACC，理论上可以提高翻译起始效率；

2. 带上阴性/阳性对照，确认抗体没有问题；

3.如果带tag，用tag的抗体杂一下；

4.建议共转GFP质粒确认转染效率。

good luck！
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3楼2011-02-22 00:45:59
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