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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】外源基因在293T细胞的表达

有一段2400bp片段插入pcDNA3.1载体——酶切、PCR和测序验证是正确的;转染进293T细胞——同时转染GFP质粒,效率达90%以上证明操作没有问题;但是48小时和36小时候裂解蛋白,western没有结果;今天更是提取总RNA,反转录,PCR,证明是有目的基因的。为什么不表达呢?
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lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-02-21 22:16:55
wuw579(金币+1): 好像应该做一个 但是没有纯蛋白 2011-02-22 11:33:47

你确认抗体是ok的?做过阳性对照没
其次,有没有移码?
2楼2011-02-21 22:09:59
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tigertang

木虫 (著名写手)


★ ★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+6): 谢谢热心解答~ 2011-02-22 08:48:29
wuw579(金币+2): 谢谢 2011-02-22 11:34:51

1. 如果带tag,确认同框;如果N端不带tag,建议在ATG前加ACC,理论上可以提高翻译起始效率;

2. 带上阴性/阳性对照,确认抗体没有问题;

3.如果带tag,用tag的抗体杂一下;

4.建议共转GFP质粒确认转染效率。

good luck!
3楼2011-02-22 00:45:59
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