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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 色谱质谱 » 【交流】用PBS缓冲液测试后碰到的问题
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nancy1984

木虫 (小有名气)

[交流] 【交流】用PBS缓冲液测试后碰到的问题

大家好。
测量一种小分子的药物。测试条件是Waters的仪器，用C18柱，内径4mm，自动进样。
按照文献报道，采用的流动相  A：PBS(M=0.08M,pH=3),  B：乙腈 A：B=65：35

在实验过程中遇到如下问题想请教下大家。
1. 配置PBS缓冲液后，用孔径0.45的PALL滤纸在砂芯漏斗上减压过滤过滤。因为先过滤的纯水，没什么问题。接着过滤PBS缓冲液的时候，流速特别慢，几乎是到了每秒才一滴，影响了实验的速度。经检测，不是漏斗的问题，因为先前过滤水的时候没问题；滤纸拿下，直接用砂芯漏斗抽滤纯水也没问题。于是怀疑是滤纸有问题。我每次都是用同一张滤纸先过滤纯水，再滤PBS。想问下大家，用0.45的滤纸过滤PBS为什么会那么慢呢? 会堵塞滤纸吗？


2.看到大家议论说，PBS缓冲液的浓度不能太大。我采用文献中的0.08M，与乙腈的比为 65：35，没有发现柱子被堵。请问这样子是不是很冒险啊。还是把浓度降低到0.01M比较保险？

3. 测试前，要将准备走PBS的通道先用纯水冲先冲洗30min是吗？比如我准备用A：PBS，B：乙腈，实验开始的时候先用乙腈稳定仪器30min,一般都是再直接用和实验条件一样的流动相配比平衡柱子1h。此次实验中因为有PBS，是不是再应该用纯水冲洗B通道冲洗30min 呢？如果是，那么此时的冲洗条件该怎么设置，乙腈和水的比例为多少比较合适呢？

4. 实验结束后，也需要用纯水冲洗色谱柱。我直接将通PBS的通道换成纯水，然后用水：乙腈=95：5冲洗30min， 再用乙腈冲洗30min。最后将色谱柱保存在纯乙腈中，这样是否合理？

5.两天两次相同条件的实验，我就测一个纯的HPLC级的物质，出峰时间由7.2min推迟到8.2min左右。这会是哪些原因引起的呢？我实验的温度是仪器恒温30度。

谢谢大家！
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1楼 2011-02-12 15:13:21
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nancy1984

木虫 (小有名气)
希望大家多多交流啊
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2楼2011-02-13 14:38:41
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mrzouhao

木虫之王 (文坛精英)
nancy1984(金币+1): 谢谢交流~ 2011-02-14 08:40:10
把浓度降低到0.01M——小心为上
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3楼2011-02-13 21:05:20
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xuzhexins0

禁虫 (小有名气)
nancy1984(金币+1): 想多听听这里高人的一间嘛~ 2011-02-14 08:40:29
本帖内容被屏蔽
4楼2011-02-13 21:40:52
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飞云

金虫 (正式写手)
nancy1984(金币+5): 非常你的建议~我会改进下实验的。 2011-02-14 11:15:40
1. 所用缓冲盐杂质过多（滤后会发现有很多黑渣，尤其是国内产品），建议每次少率一些，经常换膜，或者换用进口缓冲盐；再者，PBS存放时间过长，出现菌落，导致流速较慢；其次，盐浓度过高也是影响流速的原因。

2.缓冲盐浓度有点高，但是上到0.1也尝试过，问题不大？

3. 测试前，要将准备走PBS的通道先用纯水冲先冲洗30min？比如准备用A：PBS，B：乙腈，实验开始的时候先用乙腈稳定仪器30min,再用A:水，B：乙腈冲洗30min；然后用和实验条件一样的流动相配比平衡柱子1h，然后进样。此次实验中因为有PBS，应该用纯水冲洗A通道30min，此时的冲洗条件-乙腈和水的比例逐渐改变为与测试比例一致，并进行平衡。

4. 实验结束后，也需要用纯水冲洗PBS通道。直接将通PBS的通道换成纯水，然后水：乙腈=65：35冲洗30min；再用水：乙腈=95：5冲洗30min， 再用乙腈冲洗30min。最后将色谱柱保存在纯乙腈中

5.两天两次相同条件的实验，我就测一个纯的HPLC级的物质，出峰时间由7.2min推迟到8.2min左右。色谱柱平衡不够；缓冲盐的配制有差异。
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5楼2011-02-14 08:39:43
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zyxme

至尊木虫 (文坛精英)
nancy1984(金币+1): 谢谢你的建议，我会参考下的。 2011-02-14 11:16:01
如果反复滤过，是不是你的流动相里有膜被溶了，这样会堵砂芯斗，进而影响你的滤速。不一定对，我以前遇到过这种情况，仅供参考
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6楼2011-02-14 09:16:54
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xx小小xx

木虫 (著名写手)
nancy1984(金币+4): 2011-02-16 12:22:00
1、5楼正解。需补充一下，滤膜分正反的，用反了就容易堵、慢

2、0.2M的我也用过，这个除了浓度外，还与酸度和有机相比例有关。一般磷酸盐在酸性下溶解度大，比中性时候大很多倍

3和4、其实这个得规律很简单：开机——纯有机相——水相——缓冲液（工作流动相）——水相——纯有机相——关机。只要是含缓冲盐的基本都是这个顺序。另外要注意的是C18柱一般不能用纯水，容易损坏，所谓水相一般是指含甲醇5%~10%的水溶液。还有就是冲洗的时间与柱子的尺寸和流速有关，并不一定是30min，一般根据是流动相流过的体积达到柱体积的10倍以上

5、这个问题比较复杂，可能的原因很多，要具体分析

5
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7楼2011-02-15 23:43:23
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warmeyes

禁虫 (初入文坛)
nancy1984(金币+2): 怎么优化啊？能指点下嘛？ 2011-02-16 12:22:36
本帖内容被屏蔽
9楼2011-02-16 08:44:12
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?磭Y壹笑8楼
2011-02-16 08:19  
nancy1984(金币+1): 2011-02-16 12:22:10
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