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nancy1984

木虫 (小有名气)


[交流] 【交流】用PBS缓冲液测试后碰到的问题

大家好。
测量一种小分子的药物。测试条件是Waters的仪器,用C18柱,内径4mm,自动进样。
按照文献报道,采用的流动相  A:PBS(M=0.08M,pH=3),  B:乙腈 A:B=65:35

在实验过程中遇到如下问题想请教下大家。
1. 配置PBS缓冲液后,用孔径0.45的PALL滤纸在砂芯漏斗上减压过滤过滤。因为先过滤的纯水,没什么问题。接着过滤PBS缓冲液的时候,流速特别慢,几乎是到了每秒才一滴,影响了实验的速度。经检测,不是漏斗的问题,因为先前过滤水的时候没问题;滤纸拿下,直接用砂芯漏斗抽滤纯水也没问题。于是怀疑是滤纸有问题。我每次都是用同一张滤纸先过滤纯水,再滤PBS。想问下大家,用0.45的滤纸过滤PBS为什么会那么慢呢? 会堵塞滤纸吗?


2.看到大家议论说,PBS缓冲液的浓度不能太大。我采用文献中的0.08M,与乙腈的比为 65:35,没有发现柱子被堵。请问这样子是不是很冒险啊。还是把浓度降低到0.01M比较保险?

3. 测试前,要将准备走PBS的通道先用纯水冲先冲洗30min是吗?比如我准备用A:PBS,B:乙腈,实验开始的时候先用乙腈稳定仪器30min,一般都是再直接用和实验条件一样的流动相配比平衡柱子1h。此次实验中因为有PBS,是不是再应该用纯水冲洗B通道冲洗30min 呢?如果是,那么此时的冲洗条件该怎么设置,乙腈和水的比例为多少比较合适呢?

4. 实验结束后,也需要用纯水冲洗色谱柱。我直接将通PBS的通道换成纯水,然后用水:乙腈=95:5冲洗30min, 再用乙腈冲洗30min。最后将色谱柱保存在纯乙腈中,这样是否合理?

5.两天两次相同条件的实验,我就测一个纯的HPLC级的物质,出峰时间由7.2min推迟到8.2min左右。这会是哪些原因引起的呢?我实验的温度是仪器恒温30度。

谢谢大家!
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xuzhexins0

禁虫 (小有名气)

nancy1984(金币+1): 想多听听这里高人的一间嘛~ 2011-02-14 08:40:29
本帖内容被屏蔽

4楼2011-02-13 21:40:52
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nancy1984

木虫 (小有名气)


希望大家多多交流啊
2楼2011-02-13 14:38:41
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mrzouhao

木虫之王 (文坛精英)


nancy1984(金币+1): 谢谢交流~ 2011-02-14 08:40:10
把浓度降低到0.01M——小心为上
3楼2011-02-13 21:05:20
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飞云

金虫 (正式写手)


nancy1984(金币+5): 非常你的建议~我会改进下实验的。 2011-02-14 11:15:40
1. 所用缓冲盐杂质过多(滤后会发现有很多黑渣,尤其是国内产品),建议每次少率一些,经常换膜,或者换用进口缓冲盐;再者,PBS存放时间过长,出现菌落,导致流速较慢;其次,盐浓度过高也是影响流速的原因。

2.缓冲盐浓度有点高,但是上到0.1也尝试过,问题不大?

3. 测试前,要将准备走PBS的通道先用纯水冲先冲洗30min?比如准备用A:PBS,B:乙腈,实验开始的时候先用乙腈稳定仪器30min,再用A:水,B:乙腈冲洗30min;然后用和实验条件一样的流动相配比平衡柱子1h,然后进样。此次实验中因为有PBS,应该用纯水冲洗A通道30min,此时的冲洗条件-乙腈和水的比例逐渐改变为与测试比例一致,并进行平衡。

4. 实验结束后,也需要用纯水冲洗PBS通道。直接将通PBS的通道换成纯水,然后水:乙腈=65:35冲洗30min;再用水:乙腈=95:5冲洗30min, 再用乙腈冲洗30min。最后将色谱柱保存在纯乙腈中

5.两天两次相同条件的实验,我就测一个纯的HPLC级的物质,出峰时间由7.2min推迟到8.2min左右。色谱柱平衡不够;缓冲盐的配制有差异。
5楼2011-02-14 08:39:43
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