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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】细菌基因组的单酶切问题
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】细菌基因组的单酶切问题 已有2人参与

各位虫友，我最近做了好几次梭菌全基因组的单酶切，跑的电泳条带觉得不对劲，大家帮我看看吧，多谢虫友们啦！下边我说说具体情况。首先按照CTAB法提取了细菌的基因组DNA，1%琼脂糖电泳检测，然后0.8%琼脂糖切胶回收，试剂盒纯化，1%琼脂糖检测纯化产物。然后按照如下体系进行酶切：第一次：BamH 1   1ul，10*buffer 3  5ul，DNA 20ul ，ddH2O  24ul，总体系50ul。第二次：BamH 1   0.5ul，10*buffer3  3ul，DNA 10ul ，ddH2O  16.5ul，总体系30ul。第三次：Pme 1   1ul，10*buffer4  3ul，DNA 8ul ，100*BSA  0.3ul，ddH2O  17.7ul，总体系30ul。都是37度酶切5小时或者以上。然后1%琼脂糖电泳检测，图片在附件中。marker用的是2-log。图片中的带状都是DNA的位置开始向下一抹弥散。这是怎么造成的呢？老师说图片应该是两种情况，要么是整个泳道弥散状，要么是几条带。我怎么跑出来是一点弥散呢？
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1楼 2011-01-16 21:37:33
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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文献杰出贡献
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-17 22:52:53
Bam HI 是比较好用的酶，道理上是比较好切的，5h应该可以彻底酶切。

可以考虑：换一种酶看看，比如 Hind III，如果这个酶能切开的话，那可能是BamHI 酶有问题或者这个基因组中的BamHI切点比较稀少。

尽量用大一点的体系，能用50不用30； 做个DNA量的梯度，20ul， 10ul， 5ul。

不妨试试过夜酶切。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-01-16 21:43:23
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-16 21:43:23:
Bam HI 是比较好用的酶，道理上是比较好切的，5h应该可以彻底酶切。

可以考虑：换一种酶看看，比如 Hind III，如果这个酶能切开的话，那可能是BamHI 酶有问题或者这个基因组中的BamHI切点比较稀少。

尽量用 ...

谢谢交流！
我又用Pme 1试过了，条带基本还是一个模样。另外，我原先用的是NEB的酶，也试过了Takara的BamH 1，也是那样！晕啊！不知道怎么回事。今天让老师看了看，说让我同时用两个酶切一下看看。我想找找别人有没有单酶切过基因组，看看别人跑的电泳图是什么样子的，可是没找到。有几个文献中这么做过，遗憾的是文中没图片。唉……
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3楼2011-01-17 22:11:12
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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rainwander(金币+1): 鼓励一下~~ 2011-01-28 15:30:04
southern 做的时候大都是单酶切，我看过当时宿舍的一个搞植物的酶切图谱，是很整齐的条带。
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4楼2011-01-17 22:17:06
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-17 22:17:06:
southern 做的时候大都是单酶切，我看过当时宿舍的一个搞植物的酶切图谱，是很整齐的条带。

哦，好的，多谢啦！最近回家气氛浓厚，我先提点DNA保存好，下学期来了再做把，呵呵
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5楼2011-01-18 16:17:47
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