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花开靡霏

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】如何让一个蛋白在原核细胞中表达

目前在做的一个蛋白，分子量比较大，在70KD以上，希望在E.Coli BL21中表达。质粒构建、转化都没有问题，但是电泳看不到表达。请教有经验的给支个招，看怎么办。
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1楼 2010-12-27 16:53:41
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★ ★
花开靡霏(金币+2):谢谢参与
rainwander(金币+2):鼓励积极参与~~~ 2010-12-27 21:52:13
我的蛋白大约56kDa，在大肠里面表达量还不错。有这样的说法是：100kDa以上的蛋白在大肠中不好表达。不知道70kDa怎么样。不过，我个人认为表达应该不是问题。

我觉得你可以先换宿主试试，因为不同的宿主密码子偏好性不同，也许你的序列有稀有密码子，在这个株系里表达不是很好。最简单的办法就是换宿主，多找几种宿主细胞转化诱导。

如果这个途径还不行的话，就要考虑换载体了，这个相对于换宿主还是麻烦了些。

最后，我不清楚你这是不是第一次做表达？ 诱导温度，诱导时间，诱导剂的浓度这些条件都优化过么？如果没有的话，这个应该是你最先考虑的问题。
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2楼2010-12-27 17:19:29
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paulajjh

木虫 (著名写手)
★
花开靡霏(金币+2):谢谢参与
我的蛋白也没表达，期待有更多的人帮助你。
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3楼2010-12-27 17:54:17
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
花开靡霏(金币+2):谢谢参与
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-27 21:52:22
先看看ORF是否正确。
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4楼2010-12-27 21:01:44
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