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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教：为什么我的乙酰胆碱酯酶在400nm处没有紫外吸收？
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liutaoliu

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教：为什么我的乙酰胆碱酯酶在400nm处没有紫外吸收？

为什么我的乙酰胆碱酯酶在400nm处没有紫外吸收？条件：pH7,PBS;0.02U/uL,请高手指点，谢谢！
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1楼 2010-12-23 20:34:27
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-24 10:20:56
liutaoliu(金币+3):谢谢 2010-12-31 08:09:25
你不会是没有加底物就去测吸收值吧？蛋白的吸收峰往往在280nm处。
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2楼2010-12-23 20:37:47
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-24 10:20:45
liutaoliu(金币+3):谢谢 2010-12-31 08:09:44
引用回帖:
Originally posted by liutaoliu at 2010-12-23 20:34:27:
为什么我的乙酰胆碱酯酶在400nm处没有紫外吸收？条件：pH7,PBS;0.02U/uL,请高手指点，谢谢！

你测的是乙酰胆碱酯酶，还是酶反应的产物啊？

酶的话，蛋白质，吸收峰280nm
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3楼2010-12-23 20:40:25
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liutaoliu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-23 20:37:47:
你不会是没有加底物就去测吸收值吧？蛋白的吸收峰往往在280nm处。

谢谢回复，但我看文献上就是测的酶的啊（见下图），一直没搞明白。请问您测过吗？是测的底物氯化乙酰硫代胆碱吗？是的话，它的峰在哪儿？谢谢
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4楼2010-12-24 09:45:35
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liutaoliu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2010-12-23 20:40:25:


你测的是乙酰胆碱酯酶，还是酶反应的产物啊？

酶的话，蛋白质，吸收峰280nm

我测的是酶，请问您测的什么？要是测底物ATCl的话，峰在哪儿？谢谢
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5楼2010-12-24 09:48:03
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
liutaoliu(金币+18):谢谢指点 2010-12-31 08:10:34
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Originally posted by liutaoliu at 2010-12-24 09:45:35:

谢谢回复，但我看文献上就是测的酶的啊（见下图），一直没搞明白。请问您测过吗？是测的底物氯化乙酰硫代胆碱吗？是的话，它的峰在哪儿？谢谢

以乙酰硫代胆碱（AsCh）为底物，在乙酰胆碱酯酶（AChE）的作用下乙酰硫代胆碱（AsCh）水解成硫代胆碱和乙酸，硫代胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DTNB）产生显色反应，使反应液呈黄色，在分光光度计410nm处有最大吸收峰，用分光光度计可测得酶活性被抑制程度（用抑制率表示）。


再看看你的那篇文献中的表述，我怀疑这个图注有问题。你把方法和这个图的result 以及disccusion一起贴出来看看。
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6楼2010-12-24 10:46:02
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
我没侧过这个酶。楼主还不如先跑标准品，看看哪里出峰。
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7楼2010-12-24 11:02:42
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liutaoliu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-24 10:46:02:



以乙酰硫代胆碱（AsCh）为底物，在乙酰胆碱酯酶（AChE）的作用下乙酰硫代胆碱（AsCh）水解成硫代胆碱和乙酸，硫代胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DTNB）产生显色反应，使反应液呈黄色，在分光光度计410nm处有最 ...

好的，我们的目的是想表征酶与某一材料结合后活性未发生太大变化，我看一般都是以ACHE峰位置变化不大来表明，要是看DTNB的峰的话，理论上峰位置应该固定的，只是强度变化。谢谢了！
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8楼2010-12-24 11:46:18
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by liutaoliu at 2010-12-24 11:46:18:

好的，我们的目的是想表征酶与某一材料结合后活性未发生太大变化，我看一般都是以ACHE峰位置变化不大来表明，要是看DTNB的峰的话，理论上峰位置应该固定的，只是强度变化。谢谢了！
[img]http://pic.muchong.com ...

恩，理解这段话的意思了。这个酶在这块儿本身就有一个吸收峰，叫Soret band，这个band能反映出蛋白的构象。然后这个酶固定化之后，这个封还存在于这个位置能够说明固定化成功了。

你现在的问题是你的这个酶在这儿没有吸收峰。

那你做固定化试验了么，固定后在这里有峰出现么？ 400之后貌似就是可见光范围了。你用的是紫外可见分光光度计么？

我看不同的地方说这个峰不固定，还有在410-420的，你那里的分光光度计能做波长扫描么？最好能扫一下350-450这段。
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9楼2010-12-24 12:27:24
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liutaoliu

金虫 (正式写手)
谢谢楼上热心的兄弟（姐妹）们了，呵呵
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10楼2010-12-24 13:16:56
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liutaoliu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-24 12:27:24:



恩，理解这段话的意思了。这个酶在这块儿本身就有一个吸收峰，叫Soret band，这个band能反映出蛋白的构象。然后这个酶固定化之后，这个封还存在于这个位置能够说明固定化成功了。

你现在的问题是你的这个 ...

是的，可我固定前后均没有这个吸收峰，很是郁闷。Soret band我一直没弄明白，百度解释是卟啉化合物的吸收峰，可是AChE含卟啉结构吗？我们的仪器是紫外-可见，您说的波长扫描，意思是不是设定波长范围啊？我设的是700-200nm，有问题吗?
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11楼2010-12-24 13:45:34
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by liutaoliu at 2010-12-24 13:45:34:

是的，可我固定前后均没有这个吸收峰，很是郁闷。Soret band我一直没弄明白，百度解释是卟啉化合物的吸收峰，可是AChE含卟啉结构吗？我们的仪器是紫外-可见，您说的波长扫描，意思是不是设定波长范围啊？我设的 ...

AChE应该不含有卟啉环的。

具有波长扫描的分光光度计， 设置一定范围，然后机器就一个纳米一个纳米走波长。
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12楼2010-12-24 13:51:24
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liutaoliu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-24 13:51:24:


AChE应该不含有卟啉环的。

具有波长扫描的分光光度计， 设置一定范围，然后机器就一个纳米一个纳米走波长。

那我做的时候波长就是从高到低慢慢扫的
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13楼2010-12-24 14:35:53
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liutaoliu

金虫 (正式写手)
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Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-24 13:51:24:


AChE应该不含有卟啉环的。

具有波长扫描的分光光度计， 设置一定范围，然后机器就一个纳米一个纳米走波长。

DTNB会不会有所谓的soret band？我越来越觉得应该是加入DTNB的峰
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14楼2010-12-24 14:37:50
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
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Originally posted by liutaoliu at 2010-12-24 14:37:50:

DTNB会不会有所谓的soret band？我越来越觉得应该是加入DTNB的峰

你再仔细看看这篇文章的methods部分
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15楼2010-12-24 15:18:50
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liutaoliu

金虫 (正式写手)
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Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-24 15:18:50:


你再仔细看看这篇文章的methods部分

由于文章是电化学的，所以光学部分的描述很少，根本没有写方法，只有仪器。我查阅了一下其他文献，觉得应该是这样的：那个410nm左右的峰是TNB的。由于卟啉结构的化合物在410nm处也有吸收峰，与TNB的很接近，所以可能有人就把这个位置的峰称为soret band。作者引的那篇文献上虽有soret band,但那篇文章是有关血红蛋白（含卟啉结构）的，就血红蛋白而言，soret band确实反映了其结构。但将其引来证明乙酰胆碱酯酶结构有些断章取义，也不应用吸收峰的移动来证明，而是应该用峰的强度来证明酶固定前后的活性变化。不知您对我的看法有何意见？
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16楼2010-12-24 16:50:29
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
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Originally posted by liutaoliu at 2010-12-24 16:50:29:

由于文章是电化学的，所以光学部分的描述很少，根本没有写方法，只有仪器。我查阅了一下其他文献，觉得应该是这样的：那个410nm左右的峰是TNB的。由于卟啉结构的化合物在410nm处也有吸收峰，与TNB的很接近，所以 ...

我觉得那个峰并不能算是移动了，只是基线高了，你再看看图。峰还是在原来的波长位置，所以说用这个来证明固定上了是说得通的。

如果只有含卟啉环的蛋白才能用那个band来反映其构象的话，那这篇文章中的文献25的引用是误导或者根本就是错的。
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17楼2010-12-31 08:59:51
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liutaoliu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-31 08:59:51:



我觉得那个峰并不能算是移动了，只是基线高了，你再看看图。峰还是在原来的波长位置，所以说用这个来证明固定上了是说得通的。

如果只有含卟啉环的蛋白才能用那个band来反映其构象的话，那这篇文章中的文 ...

非常感谢！
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18楼2010-12-31 09:39:58
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