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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】AnnexinV/PI双染检测凋亡细胞，结果“诡异”，求帮助！
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richenim

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】AnnexinV/PI双染检测凋亡细胞，结果“诡异”，求帮助！

最近在做AnnexinV/PI双染检测凋亡细胞，用的是凯基生物的AnnexinV/PI试剂盒，细胞给药24小时后，有70%都变圆收缩，还有20-30%都漂了起来，但是用流式检测凋亡的结果却只有百分之几而已，请高手帮我解答下这是为什么啊？
PS:本人之前还做了hochest33342和DNA Ladder，结果都显示我的药是有促凋亡作用的。
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1楼 2010-12-10 09:31:32
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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richenim(金币+5): 2010-12-10 11:39:54
dhd997(金币+2):good 2010-12-10 14:36:59
如果你确定是有凋亡，那么我觉得应该是你制备的问题

这是我们实验室的制备方法


流式细胞术双染测凋亡的样品制备

1、        将各组细胞的培养基移入15ml离心管，加终浓度为2%的BSA。
2、        用胰酶消化细胞，吸除胰酶，加原培养基小心吹打成单细胞。
3、        1500rpm离心5min，弃尽上清。用室温平衡的PBS 1ml重悬细胞，小心吹打。

另外，你的细胞数也太少了吧，才刚刚好4次方的细胞，做流式一般要5次方个细胞才可信（当然有可能是按百分之多少显示）
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7楼2010-12-10 11:24:51
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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richenim(金币+5): 2010-12-10 11:39:23
dhd997(金币+2):good 2010-12-10 14:36:38
我们实验室用凯基的双染试剂盒就是没做出来，后来换了Trevigen的（和R&D搞贴牌的）就做出来了~

另外要考虑制备的问题，是不是制备的时候损失了很多细胞
还有就是有没有注意用无EDTA的胰酶消化细胞
如果用了EDTA的胰酶，有没有PBS洗
还有检测的时候有没有注意时间，以及避光等
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2楼2010-12-10 10:35:38
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 10:35:38:
我们实验室用凯基的双染试剂盒就是没做出来，后来换了Trevigen的（和R&D搞贴牌的）就做出来了~

另外要考虑制备的问题，是不是制备的时候损失了很多细胞
还有就是有没有注意用无EDTA的胰酶消化细胞
如果用 ...

我送检的地方都是用的凯基生物的哦，别人都可以做出来哦！
给药时间到了后，我是收集上清，再用胰酶-EDTA消化细胞，离心1000rpm，5min，再用PBS洗两次，再将细胞保存在PBS里面，拿去检测。（我从学校到送检的地方有两个小时，两个小时中细胞就保存在PBS里面，然后放在冰盒里，不知道这个时间的耽误有没有问题哦！）
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3楼2010-12-10 11:06:36
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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上图吧……结合图片给你做分析。而且我做的方法跟你的有点点不一样
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4楼2010-12-10 11:09:37
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