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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】AnnexinV/PI双染检测凋亡细胞，结果“诡异”，求帮助！
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richenim

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】AnnexinV/PI双染检测凋亡细胞，结果“诡异”，求帮助！

最近在做AnnexinV/PI双染检测凋亡细胞，用的是凯基生物的AnnexinV/PI试剂盒，细胞给药24小时后，有70%都变圆收缩，还有20-30%都漂了起来，但是用流式检测凋亡的结果却只有百分之几而已，请高手帮我解答下这是为什么啊？
PS:本人之前还做了hochest33342和DNA Ladder，结果都显示我的药是有促凋亡作用的。
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1楼 2010-12-10 09:31:32
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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richenim(金币+5): 2010-12-10 11:39:54
dhd997(金币+2):good 2010-12-10 14:36:59
如果你确定是有凋亡，那么我觉得应该是你制备的问题

这是我们实验室的制备方法


流式细胞术双染测凋亡的样品制备

1、        将各组细胞的培养基移入15ml离心管，加终浓度为2%的BSA。
2、        用胰酶消化细胞，吸除胰酶，加原培养基小心吹打成单细胞。
3、        1500rpm离心5min，弃尽上清。用室温平衡的PBS 1ml重悬细胞，小心吹打。

另外，你的细胞数也太少了吧，才刚刚好4次方的细胞，做流式一般要5次方个细胞才可信（当然有可能是按百分之多少显示）
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7楼2010-12-10 11:24:51
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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richenim(金币+5): 2010-12-10 11:39:23
dhd997(金币+2):good 2010-12-10 14:36:38
我们实验室用凯基的双染试剂盒就是没做出来，后来换了Trevigen的（和R&D搞贴牌的）就做出来了~

另外要考虑制备的问题，是不是制备的时候损失了很多细胞
还有就是有没有注意用无EDTA的胰酶消化细胞
如果用了EDTA的胰酶，有没有PBS洗
还有检测的时候有没有注意时间，以及避光等
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2楼2010-12-10 10:35:38
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 10:35:38:
我们实验室用凯基的双染试剂盒就是没做出来，后来换了Trevigen的（和R&D搞贴牌的）就做出来了~

另外要考虑制备的问题，是不是制备的时候损失了很多细胞
还有就是有没有注意用无EDTA的胰酶消化细胞
如果用 ...

我送检的地方都是用的凯基生物的哦，别人都可以做出来哦！
给药时间到了后，我是收集上清，再用胰酶-EDTA消化细胞，离心1000rpm，5min，再用PBS洗两次，再将细胞保存在PBS里面，拿去检测。（我从学校到送检的地方有两个小时，两个小时中细胞就保存在PBS里面，然后放在冰盒里，不知道这个时间的耽误有没有问题哦！）
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3楼2010-12-10 11:06:36
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
上图吧……结合图片给你做分析。而且我做的方法跟你的有点点不一样
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4楼2010-12-10 11:09:37
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richenim

金虫 (小有名气)
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5楼2010-12-10 11:17:48
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 11:09:37:
上图吧……结合图片给你做分析。而且我做的方法跟你的有点点不一样

你做的和我哪里有点点不一样哦？
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6楼2010-12-10 11:18:43
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
另外，如果细胞比较脆，在离心前先37℃孵育几分钟
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8楼2010-12-10 11:26:03
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 11:24:51:
如果你确定是有凋亡，那么我觉得应该是你制备的问题

这是我们实验室的制备方法


流式细胞术双染测凋亡的样品制备

1、        将各组细胞的培养基移入15ml离心管，加终浓度为2%的BSA。
2、        用胰酶消化细胞，吸 ...

我的细胞很多的，我是用25ml的培养瓶养的，是我拿过去的时候，那个检测的人只取了一部分检测的哦！
加BSA要加多少毫升啊？只要是终浓度是2%就行了吗？
我的细胞很难消化，一般要用胰酶使细胞飘起来一部分后才能完全吹打下来哦！
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9楼2010-12-10 11:36:19
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
richenim(金币+5): 2010-12-10 15:27:42
rainwander(金币+2):鼓励积极参与~~~ 2010-12-12 00:27:53
引用回帖:
Originally posted by richenim at 2010-12-10 11:36:19:


我的细胞很多的，我是用25ml的培养瓶养的，是我拿过去的时候，那个检测的人只取了一部分检测的哦！
加BSA要加多少毫升啊？只要是终浓度是2%就行了吗？
我的细胞很难消化，一般要用胰酶使细胞飘起来一部分后 ...

是的，终浓度2%即可
这一步是用于保护细胞的
因为凋亡的细胞的细胞膜很脆弱，所以在制备的过程中很容易破掉，这样离心的时候就只能收集到碎片，而碎片在上流检测时会被截掉，导致假阴性
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10楼2010-12-10 12:14:16
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 12:14:16:


是的，终浓度2%即可
这一步是用于保护细胞的
因为凋亡的细胞的细胞膜很脆弱，所以在制备的过程中很容易破掉，这样离心的时候就只能收集到碎片，而碎片在上流检测时会被截掉，导致假阴性

非常感谢哈！
那用胰酶消化下来的细胞需要加2%BSA保护吗？
将培养基中的细胞和胰酶消化下来的细胞一起收集后，需要用PBS洗涤吗？
我将最后收集的细胞重悬在1mlPBS中，放在冰盒里面拿去检测（将装有细胞的离心管插在冰上要好一些，还是只在冰盒里放一些冰袋就行了啊？），路途又将近两个小时，不知道这两个小时对检测结果有没有影响？
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11楼2010-12-10 15:35:37
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
richenim(金币+3): 2010-12-10 18:22:52
dhd997(金币+2):good 2010-12-11 08:38:18
引用回帖:
Originally posted by richenim at 2010-12-10 15:35:37:


非常感谢哈！
那用胰酶消化下来的细胞需要加2%BSA保护吗？
将培养基中的细胞和胰酶消化下来的细胞一起收集后，需要用PBS洗涤吗？
我将最后收集的细胞重悬在1mlPBS中，放在冰盒里面拿去检测（将装有细胞的离 ...

注意到，首先我是把培养上清转移到15ml离心管里头，加好BSA
然后消化细胞，吸掉胰酶吹打细胞用的是原来的培养基
因为这一步要吹打成单细胞，所以需要BSA保护

细胞打散后，要离心，用PBS洗一遍，离心再用PBS重悬
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12楼2010-12-10 16:33:08
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by richenim at 2010-12-10 15:35:37:


非常感谢哈！
那用胰酶消化下来的细胞需要加2%BSA保护吗？
将培养基中的细胞和胰酶消化下来的细胞一起收集后，需要用PBS洗涤吗？
我将最后收集的细胞重悬在1mlPBS中，放在冰盒里面拿去检测（将装有细胞的离 ...

要插在冰上才行……2h也太久了一点……
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13楼2010-12-10 16:34:24
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 16:34:24:


要插在冰上才行……2h也太久了一点……

恩，是的。我后来问了个老师他说两个小时太久了，那个细胞膜都改变了，染料都染不上了哦，那可不可以直接把细胞拿过去（我用25ml的培养瓶养的细胞），拿过去后再收集细胞啊？后面的收集细胞可不可以不用无菌操作哦？
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14楼2010-12-11 01:04:00
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
richenim(金币+2): 2010-12-11 13:53:02
引用回帖:
Originally posted by richenim at 2010-12-11 01:04:00:


恩，是的。我后来问了个老师他说两个小时太久了，那个细胞膜都改变了，染料都染不上了哦，那可不可以直接把细胞拿过去（我用25ml的培养瓶养的细胞），拿过去后再收集细胞啊？后面的收集细胞可不可以不用无菌操 ...

可以。但是2个小时的运输，脱离的培养条件，可能会对你的凋亡现象产生影响

可以不用无菌操作。
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15楼2010-12-11 10:05:55
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-11 10:05:55:


可以。但是2个小时的运输，脱离的培养条件，可能会对你的凋亡现象产生影响

可以不用无菌操作。

现在也只有试试了哦！
我想问下你做周期是不是要先将细胞饥饿了使之同步化了再给药刺激哦！要饥饿多久才行啊？最后用乙醇固定的时候，我查资料有70%、75%和95%乙醇，那到底用那一种哦？
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16楼2010-12-11 13:56:47
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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richenim(金币+10): 2010-12-11 22:27:20
引用回帖:
Originally posted by richenim at 2010-12-11 13:56:47:

现在也只有试试了哦！
我想问下你做周期是不是要先将细胞饥饿了使之同步化了再给药刺激哦！要饥饿多久才行啊？最后用乙醇固定的时候，我查资料有70%、75%和95%乙醇，那到底用那一种哦？

看情况，我不习惯做同步化。如果做不出阳性结果再试试同步化

我们实验室的protocol

流式细胞术测细胞周期样品制备

1、        消化细胞，用完全培养基重悬，并用中枪充分吹打成单细胞悬液。
2、        1000~1500rpm离心5min，弃尽上清，加500ul PBS轻柔重悬。
3、        缓慢加入1.5ml无水乙醇，边加边摇匀。
4、        置4℃固定过夜。
5、        同法离心，去除乙醇。避光条件下加500ul PI染液重悬，移入流式管。
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17楼2010-12-11 15:30:23
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-11 15:30:23:


看情况，我不习惯做同步化。如果做不出阳性结果再试试同步化

我们实验室的protocol

流式细胞术测细胞周期样品制备

1、        消化细胞，用完全培养基重悬，并用中枪充分吹打成单细胞悬液。
2、        1000~1500 ...

1、做不出阳性结果？怎样才是阳性结果啊？是前面要有亚二倍体峰吗？
2、悬浮在培养基中的细胞要收集不？离心得到细胞后腰用PBS洗涤不？
3、缓慢加入1.5ml无水乙醇，边加边摇匀，加完后还需要用枪吹打混匀不？
4、固定后腰在多久时间内检测啊？
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18楼2010-12-11 22:38:49
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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Originally posted by richenim at 2010-12-11 22:38:49:

1、做不出阳性结果？怎样才是阳性结果啊？是前面要有亚二倍体峰吗？
2、悬浮在培养基中的细胞要收集不？离心得到细胞后腰用PBS洗涤不？
3、缓慢加入1.5ml无水乙醇，边加边摇匀，加完后还需要用枪吹打混匀不？ ...

哈，我以为你是做周期……不是做凋亡

sub G1法我们从来不用，如果是S phase dependent的凋亡或者G2/M时期的，那可能根本就观察不到sub G1，这个方法假阴性极高。而且不懂的人把碎片峰当sub G1看了，贻笑大方……
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19楼2010-12-11 23:26:22
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-11 23:26:22:


哈，我以为你是做周期……不是做凋亡

sub G1法我们从来不用，如果是S phase dependent的凋亡或者G2/M时期的，那可能根本就观察不到sub G1，这个方法假阴性极高。而且不懂的人把碎片峰当sub G1看了，贻笑大 ...

哦，原来是这样啊！我刚做了一个周期，结果是G2/M时期依赖性增加，但没有sub G0/G1期的峰出现，但我看的外文文献上面几乎都有这个sub G0/G1期哦！
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20楼2010-12-12 23:35:45
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shadowfly

木虫 (小有名气)
★
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细胞为什么要放冰盒里呢？按说直接揣过去就好，损伤多
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21楼2010-12-13 00:11:49
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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Originally posted by richenim at 2010-12-12 23:35:45:

哦，原来是这样啊！我刚做了一个周期，结果是G2/M时期依赖性增加，但没有sub G0/G1期的峰出现，但我看的外文文献上面几乎都有这个sub G0/G1期哦！

我不知道你看什么档次的文献哦~反正这个技术是绝对会被淘汰的
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22楼2010-12-13 10:25:57
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shadowfly at 2010-12-13 00:11:49:
细胞为什么要放冰盒里呢？按说直接揣过去就好，损伤多

直接揣过去的话也能承受两个小时的路途吗？你是说收集的细胞直接揣过去吗？
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23楼2010-12-13 12:47:27
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-13 10:25:57:


我不知道你看什么档次的文献哦~反正这个技术是绝对会被淘汰的

还有个问题需要请教你下哦！
做细胞周期，细胞固定后可以放置多久啊？我的样品还比较多的，我想分几批做了后一起拿过去，这样的话就有些固定了的细胞要放置比较长时间（大概一个星期左右吧），不知道可行不？
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24楼2010-12-14 15:55:33
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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引用回帖:
Originally posted by richenim at 2010-12-14 15:55:33:


还有个问题需要请教你下哦！
做细胞周期，细胞固定后可以放置多久啊？我的样品还比较多的，我想分几批做了后一起拿过去，这样的话就有些固定了的细胞要放置比较长时间（大概一个星期左右吧），不知道可行不？

没试过这么久，一般固定过夜
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25楼2010-12-14 16:47:16
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richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-11 23:26:22:
哈，我以为你是做周期……不是做凋亡

sub G1法我们从来不用，如果是S phase dependent的凋亡或者G2/M时期的，那可能根本就观察不到sub G1，这个方法假阴性极高。而且不懂的人把碎片峰当sub G1看了，贻笑大 ...

我想请教下你，现在我的文章投出去后有了审稿意见，其中有个审稿人就指出我的细胞周期分布图上面为什么没有sub-G1峰哦，我该怎么回复呢？
PS：细胞周期分布我是用PI单染做的，结果是细胞周期阻滞在G2/M期；流式双染的细胞凋亡率为20％(诱导24h)，DNA Ladder的结果是在24h检测，Ladder现象看不到，但作用36h后Ladder现象很明显啊！

谢谢了哈！
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26楼2011-09-16 14:21:06
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hallen6891

新虫 (小有名气)
★
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细胞数目应该是足够了的，我一般做凋亡收1万或者2万个细胞都可以做，结果都是很好的，而且我收细胞的时候都是用2000rpm收集的，就像三磷酸腺苷说的那样，应该是样品制备存在一定的问题。
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27楼2012-11-29 16:26:48
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yu321chao

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
904901楼: Originally posted by richenim at 2010-12-14 15:55:33
还有个问题需要请教你下哦！
做细胞周期，细胞固定后可以放置多久啊？我的样品还比较多的，我想分几批做了后一起拿过去，这样的话就有些固定了的细胞要放置比较长时间（大概一个星期左右吧），不知道可行不？...

你好，我想请教一个问题，我测凋亡的时候，图上面显示的点群只是出现平移，没有出现两组点群是怎么回事啊？求教~~
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28楼2012-12-21 21:01:45
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hgh99618

金虫 (正式写手)
★
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这是一个很有意思的问题。你已经知道你用的药物能诱导凋亡，那就应该能做出来。除了以上楼主所说的原因，还有：细胞不能太少，因为你的药物诱导凋亡后--你介绍的20-30%的细胞漂浮起来，说明有大量细胞死亡。另外，在收获细胞时，要注意不要离心时间太长、转数不要高。还有，你说2小时后送检，如果是加了荧光试剂，2小时就衰减很多了，再延长时间久明显减少荧光细胞的数量。不知你怎么看？
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29楼2012-12-21 22:57:39
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ququ1105

银虫 (小有名气)
★
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细胞凋亡用无EDTA的胰酶消化。
你的离心速度有多少，飘起来的细胞是否都收集了进去？别使劲吹细胞，怕把细胞吹坏，用手弹。
上流式时圈门的时候是不是外面有很多死细胞？这些已经死了的没有圈进去的话，也可能造成图里没有显示。
是到了老师那里才染得色吧？我觉得请教一下测流式的老师为好。
不要用太多的液体重悬，流式200ul就够了，但是细胞数目控制好，不要太多，多了染色染不上。
细胞固定理论上一个月都是没有问题的，一个星期完全可以。
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30楼2013-04-04 20:16:40
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lizh736

银虫 (正式写手)
★
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楼主，我也遇到跟你同样的问题。我跟你用的是同一个牌子的燃料。也是没有阳性结果。但是PI的信号很高。不知楼主是否解决？
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31楼2013-04-10 20:40:54
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begining

木虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
31楼: Originally posted by lizh736 at 2013-04-10 20:40:54
楼主，我也遇到跟你同样的问题。我跟你用的是同一个牌子的燃料。也是没有阳性结果。但是PI的信号很高。不知楼主是否解决？

我也出现同样的问题，用的碧云天的，PI染色了，FITC染不上，误差值也很大
你的问题解决了吗？
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32楼2013-06-11 16:48:03
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xiaoleohong

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
正在纠结怎么用AnneinV-GFP/PI染料做凋亡细胞检测，能不能去请求各位前辈发下具体步骤哟？
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33楼2013-06-25 20:50:44
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一旺百旺

新虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
13楼: Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 16:34:24
要插在冰上才行……2h也太久了一点……...

加入染色剂后，凯基试剂盒上是说室温，避光5-15min,那为啥还要插在冰里呢？
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34楼2014-04-21 12:25:56
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yyy0305

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
估计你给药的浓度过高了，细胞都被毒死了。建议你先做个药敏实验测细胞的活力，看看药物对细胞的IC50。凋亡时一个缓慢渐近的过程，凋亡早期细胞的形态不会发生发生太大的变化，70%都变圆收缩不是个正常现象
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35楼2015-05-29 09:43:28
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_远桥

铜虫 (初入文坛)
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引用回帖:
35楼: Originally posted by yyy0305 at 2015-05-29 09:43:28
估计你给药的浓度过高了，细胞都被毒死了。建议你先做个药敏实验测细胞的活力，看看药物对细胞的IC50。凋亡时一个缓慢渐近的过程，凋亡早期细胞的形态不会发生发生太大的变化，70%都变圆收缩不是个正常现象

请问凋亡实验中药物浓度一般选多少比较好呢？
是IC50左右还是比IC50再小一点比较好？
谢谢
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36楼2015-07-08 10:59:10
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Lily Li

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你是不是PI没染上，然后凋亡细胞算在坏死细胞里边去了
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37楼2016-01-19 06:26:22
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