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djrhewc

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】18s全长pcr问题~ 已有2人参与

如题,正在做沉积物DNA18s全长扩增,引物采用NS1和NS8,现在什么也没扩出来,而用传统分离方法从沉积物中分离出的单菌做18s扩增却可以正常扩出来,而且效果还不错,这是不是可以说明引物和反应体系以及条件都没有问题,有问题的是模板DNA?如果是这样的话,应该怎样来处理模板?
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won7

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
18S能够形成复杂的二级结构,想一次扩增全长是很有困难的,建议分段扩增。
3楼2010-12-10 17:10:01
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djrhewc

银虫 (小有名气)

有人能指点下么?
2楼2010-12-10 16:23:06
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djrhewc

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by won7 at 2010-12-10 17:10:01:
18S能够形成复杂的二级结构,想一次扩增全长是很有困难的,建议分段扩增。

分段扩增?18s还不到2000bp,应该不需要用到吧
4楼2010-12-15 15:48:48
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won7

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2010-12-15 17:53:24
引用回帖:
Originally posted by djrhewc at 2010-12-15 15:48:48:

分段扩增?18s还不到2000bp,应该不需要用到吧

尽管长度对PCR来说不算长,但对这样种基因,分段对于后续克隆和测序都很有好处。我做过18S全长扩增,用TAKALA的GC buffer比较好扩增出来,但克隆和测序很难进行。后来做28S(约3.7Kb)我分成8段来扩增,顺利很多。
5楼2010-12-15 16:27:42
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