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银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】18s全长pcr问题~ 已有2人参与

如题，正在做沉积物DNA18s全长扩增，引物采用NS1和NS8，现在什么也没扩出来，而用传统分离方法从沉积物中分离出的单菌做18s扩增却可以正常扩出来，而且效果还不错，这是不是可以说明引物和反应体系以及条件都没有问题，有问题的是模板DNA？如果是这样的话，应该怎样来处理模板?

1楼 2010-12-08 11:44:53

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金虫 (小有名气)

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18S能够形成复杂的二级结构，想一次扩增全长是很有困难的，建议分段扩增。

3楼2010-12-10 17:10:01

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金虫 (小有名气)

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rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2010-12-15 17:53:24

引用回帖:

Originally posted by djrhewc at 2010-12-15 15:48:48:

分段扩增？18s还不到2000bp，应该不需要用到吧

尽管长度对PCR来说不算长，但对这样种基因，分段对于后续克隆和测序都很有好处。我做过18S全长扩增，用TAKALA的GC buffer比较好扩增出来，但克隆和测序很难进行。后来做28S（约3.7Kb）我分成8段来扩增，顺利很多。

5楼2010-12-15 16:27:42

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