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gundamba

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】做完连接转化居然掉下一段基因...?求答案已有10人参与

做连接,转化大肠,本来是6000的载体加1000多的片段,粗提质粒电泳图除了少量自连以外,其余都往下掉到了2000多的条带处。以前没有过这种情况,载体基础质粒是PUC19,做过很多次了,同实验室的人也发生了这种情况,没有连上反而掉了一大截(并不是转化时剪切作用掉下的那么一点,是很大一块),有哪位朋友能给个解释啊,着急死了!
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木虫 (小有名气)

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Originally posted by zgb1982 at 2010-11-11 10:53:41:
用质粒电泳检测时,用什么marker判断质粒大小呢,和什么比掉了2000多呢!

我用1kb的MAKER做的对照,跟原质粒做对比
3楼2010-11-11 13:11:26
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木虫 (小有名气)

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Originally posted by jhu132llh at 2010-11-11 16:08:46:
是不是连接buffer污染了酶,质粒在连接过程中发生了意外酶切,很有可能的,查查看吧。
质粒肯定不会无缘无故变小的。

非常感谢你的参与,我一开始也是这么想的,但是同实验室的同学也出现了这个问题,而大家用的酶都是独立的,所以不太可能是这种情况。
5楼2010-11-11 20:06:20
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木虫 (小有名气)

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Originally posted by lvbobo823 at 2010-11-12 17:11:15:
最好用载体跟插入片断上有的酶切一下,看一下酶切片断大小是否对。

做连接以前都跑过电泳了,没问题,确实是我要连接的东西,现在掉完以后剩下的大小比我的基础质粒还小...
13楼2010-11-12 19:49:40
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木虫 (小有名气)

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Originally posted by gundamba at 2010-11-11 20:06:20:

非常感谢你的参与,我一开始也是这么想的,但是同实验室的同学也出现了这个问题,而大家用的酶都是独立的,所以不太可能是这种情况。

就是1KBP的maker,我做大批量的,结果虽然还是大部分往下掉,但是筛出了两株没掉的我要的质粒了....奇怪了
14楼2010-12-03 11:27:58
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Originally posted by xiangshengyan at 2010-11-12 10:52:23:
用相同的条件再做一次 要是出现同样的结果 再进行研究

不是的,因为掉的太大了,后来重复试验做出来了,但是掉的情况还是很普遍,呵呵,谢谢!
15楼2010-12-03 11:28:56
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Originally posted by beisimai895 at 2010-12-03 11:44:22:
楼主你是拿连完后的质粒作电泳的吗,如果是这样的话,你的实验本来就存在误区,因为质粒的结构比较特殊,所以不能通过电泳来观察大小,一般都是酶切之后电泳来检测大小的,这个内容你上网查一下就知道了,而且你们 ...

这个我当然懂了,我们跑的时候把原质粒也带上了,如果连接成功应该比原质粒大,首先确定这个以后再精提质粒酶切验证大小。我们实验室没这么弱!谢谢!
18楼2010-12-07 17:08:59
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