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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】Fosmid文库双酶切切不开！急求
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方亚楠

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】Fosmid文库双酶切切不开！急求 已有2人参与

我今天做Fosmid克隆的双酶切，用的是EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的双酶切，载体大小为8100bp，我的目的片段是35Kb，参考的文献上是用这两种酶切的，而且能切开，我的结果没有切开，跑的普通琼脂糖电泳，23Kb的marker都已经跑开了，但是Fosmid没有切开，在点样孔附近有一大团。好奇怪，为什么没切开呢，我的酶量各加了1u，同时怕酶浓度太大，所以又做了酶量为0.5ul的，可是都没有切开。不知道哪里出问题了，有做过Fosmid克隆酶切的吗？急求原因了，我在想是不是有必要跑脉冲场电泳来检测啊？还是换用Not Ⅰ进行酶切呢？

非常感谢大家，这是我实验的最后一步了，如果这步做完了就基本上毕业了，谢谢大家了
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1楼 2010-11-08 17:58:41
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+10):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-08 23:10:35
我初步分析一下：

你的凝胶浓度应该跑0.8%或者更低的；

如果你的23kb 的 lamda DNA marker都已经分开的话，那么你的质粒不应该集中在

点样孔附近，因为如果那是未酶切开的质粒的话道理上来讲应该跑出孔去的；

你在说你的酶量的时候并未说你的酶切体系大小；

我的一点怀疑及一点建议：

我怀疑你的粘粒DNA没有提取好，里面含杂质较多，要么是蛋白质，要么是基因组DNA；

我的建议是，你双酶切切不开，你做单酶切了么？比如你用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的单酶切作为双酶切的对照，如果两个单酶切都能切开，这能说明什么？如果两个单酶切都切不开或者只有一个能切开，这又说明什么?

呵呵，实验做不出来的时候，再次重复的时候一定要做对照，否则盲目重复没有任何意义。

祝好运
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2010-11-08 22:47:07
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方亚楠

新虫 (初入文坛)
★
dhd997(金币+1):鼓励回帖交流。 2010-11-09 08:26:48
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-11-08 22:47:07:
我初步分析一下：

你的凝胶浓度应该跑0.8%或者更低的；

如果你的23kb 的 lamda DNA marker都已经分开的话，那么你的质粒不应该集中在

点样孔附近，因为如果那是未酶切开的质粒的话道理上来讲应该跑出孔去 ...

太感谢你了，说的这么透彻，我今天就按照你说的试试，单酶切也做，然后再多试几种酶，谢谢啦！也祝你好运哦
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3楼2010-11-09 08:21:56
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