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【求助/交流】Fosmid文库双酶切切不开！急求 已有2人参与
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我今天做Fosmid克隆的双酶切，用的是EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的双酶切，载体大小为8100bp，我的目的片段是35Kb，参考的文献上是用这两种酶切的，而且能切开，我的结果没有切开，跑的普通琼脂糖电泳，23Kb的marker都已经跑开了，但是Fosmid没有切开，在点样孔附近有一大团。好奇怪，为什么没切开呢，我的酶量各加了1u，同时怕酶浓度太大，所以又做了酶量为0.5ul的，可是都没有切开。不知道哪里出问题了，有做过Fosmid克隆酶切的吗？急求原因了，我在想是不是有必要跑脉冲场电泳来检测啊？还是换用Not Ⅰ进行酶切呢？ 非常感谢大家，这是我实验的最后一步了，如果这步做完了就基本上毕业了，谢谢大家了  |
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3楼2010-11-09 08:21:56
brightfuture01
木虫之王 (文坛精英)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+10):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-08 23:10:35
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我初步分析一下： 你的凝胶浓度应该跑0.8%或者更低的； 如果你的23kb 的 lamda DNA marker都已经分开的话，那么你的质粒不应该集中在 点样孔附近，因为如果那是未酶切开的质粒的话道理上来讲应该跑出孔去的； 你在说你的酶量的时候并未说你的酶切体系大小； 我的一点怀疑及一点建议： 我怀疑你的粘粒DNA没有提取好，里面含杂质较多，要么是蛋白质，要么是基因组DNA； 我的建议是，你双酶切切不开，你做单酶切了么？比如你用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的单酶切作为双酶切的对照，如果两个单酶切都能切开，这能说明什么？如果两个单酶切都切不开或者只有一个能切开，这又说明什么? 呵呵，实验做不出来的时候，再次重复的时候一定要做对照，否则盲目重复没有任何意义。 祝好运 |
2楼2010-11-08 22:47:07
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