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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】如何提高连接效率？
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】如何提高连接效率？ 已有3人参与

最近实验比较郁闷，克隆有蓝白斑，但是没鉴定出插入片段，后来做了一次连接质粒的电泳，发现没有条带，请问，怎么提高连接效率？
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1楼 2010-09-26 15:40:29
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2):欢迎交流！ 2010-09-26 20:20:55
1.PCR产物胶回收后再连接
2.是不是kit出了问题
3.插入片段与载体的摩尔比最好控制在1-3:1
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2楼2010-09-26 17:06:30
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lixg at 2010-09-26 17:06:30:
1.PCR产物胶回收后再连接
2.是不是kit出了问题
3.插入片段与载体的摩尔比最好控制在1-3:1

我对PCR产物进行了割胶回收，用的是爱思进的凝胶回收试剂盒，回收出来了总共30ul,怎么测DNA浓度啊，我要是稀释的话，稀释的倍数就太大了，误差也会很大，有时候测出来就是负的，我想请问一下，插入片段与载体的摩尔比很重要吗？要怎么测回收出来的DNA浓度啊？我一般都是加1ul载体，1ul插入DNA
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3楼2010-09-26 17:27:28
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Lee_Py

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
想测浓度用紫外分光光度计测OD就可以啊 也不知道你连接加的酶啊 载体啊加多少μ 咋知道你问题出哪
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4楼2010-09-26 18:23:45
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by Lee_Py at 2010-09-26 18:23:45:
想测浓度用紫外分光光度计测OD就可以啊 也不知道你连接加的酶啊 载体啊加多少μ 咋知道你问题出哪

载体是50ng,酶的含量就不知道了，用 的是试剂盒里的溶液，里面成分是什么，含量是多少都不知道。。。。。
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5楼2010-09-27 08:42:01
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
确实，用分光光度计检测时，如果浓度低于检测的最低阈值，读数为负值。我们都是将回收后的PCR产物跑个电泳，和marker比较下就能知道大致的浓度。
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6楼2010-09-27 08:55:34
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