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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】如何提高连接效率? 已有3人参与

最近实验比较郁闷,克隆有蓝白斑,但是没鉴定出插入片段,后来做了一次连接质粒的电泳,发现没有条带,请问,怎么提高连接效率?
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2):欢迎交流! 2010-09-26 20:20:55
1.PCR产物胶回收后再连接
2.是不是kit出了问题
3.插入片段与载体的摩尔比最好控制在1-3:1
2楼2010-09-26 17:06:30
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by lixg at 2010-09-26 17:06:30:
1.PCR产物胶回收后再连接
2.是不是kit出了问题
3.插入片段与载体的摩尔比最好控制在1-3:1

我对PCR产物进行了割胶回收,用的是爱思进的凝胶回收试剂盒,回收出来了总共30ul,怎么测DNA浓度啊,我要是稀释的话,稀释的倍数就太大了,误差也会很大,有时候测出来就是负的,我想请问一下,插入片段与载体的摩尔比很重要吗?要怎么测回收出来的DNA浓度啊?我一般都是加1ul载体,1ul插入DNA
3楼2010-09-26 17:27:28
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Lee_Py

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
想测浓度用紫外分光光度计测OD就可以啊 也不知道你连接加的酶啊 载体啊加多少μ 咋知道你问题出哪
4楼2010-09-26 18:23:45
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by Lee_Py at 2010-09-26 18:23:45:
想测浓度用紫外分光光度计测OD就可以啊 也不知道你连接加的酶啊 载体啊加多少μ 咋知道你问题出哪

载体是50ng,酶的含量就不知道了,用 的是试剂盒里的溶液,里面成分是什么,含量是多少都不知道。。。。。
5楼2010-09-27 08:42:01
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
确实,用分光光度计检测时,如果浓度低于检测的最低阈值,读数为负值。我们都是将回收后的PCR产物跑个电泳,和marker比较下就能知道大致的浓度。
6楼2010-09-27 08:55:34
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