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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】电转化效率
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】电转化效率 已有3人参与

电转化大肠杆菌，转化的是DNA片段，电转杯是0.1的，条件是1500V，5ms，转了好多次都是失败，感受态制备时用10%的甘油1ml洗3次，转化时是先加5微升片段冰上放置5min，再加5微升再放5min，如何可以提高电转化的效率？先在这边谢过了！！
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上班族，学习ing……
1楼 2010-06-01 16:56:19
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小白兄

金虫 (小有名气)
★ ★
dhmdddd(金币+1):谢谢! 2010-06-01 19:30:11
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-06-02 22:36:19
我们实验室也是用的电转化，电压比你高1800V，一般我们是批量制感受态，放-80，转化时先冰上放置2-3min，质粒一般加1ul，连接产物转2ul，复苏1h，质粒一般涂1ul，连接产物看情况。我不知道你这里的DNA片段是没有环化的片段还是连接产物。你转化率低低到什么程度？
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时光如流水，匆匆而过。
2楼2010-06-01 18:27:34
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 小白兄 at 2010-06-01 18:27:34:
我们实验室也是用的电转化，电压比你高1800V，一般我们是批量制感受态，放-80，转化时先冰上放置2-3min，质粒一般加1ul，连接产物转2ul，复苏1h，质粒一般涂1ul，连接产物看情况。我不知道你这里的DNA片段是没有环 ...

我用的电转杯是0.1的，所以电压没有用那么高的，我连的是DNA片段，不是环状的，2000多的吧，我涂布复苏1h后的细胞在氯霉素抗性平板上就是不长，抗生素的浓度比转化质粒的要低很多，就是没有单菌长出来……
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上班族，学习ing……
3楼2010-06-01 19:29:15
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lingn

木虫 (正式写手)
★ ★
dhmdddd(金币+1):谢谢，还有问题请教！ 2010-06-01 20:17:12
lstt09nk(金币+2):欢迎交流~ 2010-06-01 20:27:05
拿已知浓度的质粒先测一下感受态的效果怎么样。如果好的话再转连接产物，如果没菌斑就是连接的问题了。
另外你3次都用1ml洗吗？洗不干净吧，前两次体积可以大一点，反正要离心的。
你居然加了10ul的连接产物，也不怕爆，我最多加4ul。加多了很容易爆的，一旦爆了肯定长不出斑来。
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4楼2010-06-01 19:43:31
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lingn at 2010-06-01 19:43:31:
拿已知浓度的质粒先测一下感受态的效果怎么样。如果好的话再转连接产物，如果没菌斑就是连接的问题了。
另外你3次都用1ml洗吗？洗不干净吧，前两次体积可以大一点，反正要离心的。
你居然加了10ul的连接产物，也 ...

板上有菌长出来，但是怀疑是抗生素浓度太低的原因，长的菌很小，长不大，这样是不是可以说明细胞没有爆啊？质粒这个还没有试过，下次做的时候做一个对照了，下次做感受态洗的时候就知道了，十分感谢！！
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上班族，学习ing……
5楼2010-06-01 20:22:57
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lingn

木虫 (正式写手)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-06-02 22:36:32
dhmdddd(金币+1):谢谢！ 2010-06-03 13:33:33
引用回帖:
Originally posted by dhmdddd at 2010-06-01 20:22:57:


板上有菌长出来，但是怀疑是抗生素浓度太低的原因，长的菌很小，长不大，这样是不是可以说明细胞没有爆啊？质粒这个还没有试过，下次做的时候做一个对照了，下次做感受态洗的时候就知道了，十分感谢！！

抗生素浓度高了，菌长的就慢。浓度低的话，应该是长的快才对啊。如果是阳性的，时间长了总会长大的呀。是一个一个斑吗？还是一片的？
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6楼2010-06-02 22:09:43
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lingn at 2010-06-02 22:09:43:


抗生素浓度高了，菌长的就慢。浓度低的话，应该是长的快才对啊。如果是阳性的，时间长了总会长大的呀。是一个一个斑吗？还是一片的？

是一片的，并且菌长不大，同样浓度的抗生素质粒转化的长的明显电转化的快，并且大……有一片的菌长出来是不是就说明电转化时没有爆啊？
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上班族，学习ing……
7楼2010-06-03 13:36:41
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lingn

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by dhmdddd at 2010-06-03 13:36:41:



是一片的，并且菌长不大，同样浓度的抗生素质粒转化的长的明显电转化的快，并且大……有一片的菌长出来是不是就说明电转化时没有爆啊？

不能说明，长的一片的都是死的菌。如果爆的话，会听到轻微的一声响。
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8楼2010-06-04 13:47:52
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