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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于MTT检测淋巴细胞活性的若干问题，请教各位大侠~~
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hcming

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于MTT检测淋巴细胞活性的若干问题，请教各位大侠~~ 已有8人参与

最近在做MTT的实验，有些问题想请教各位，先谢谢大家了~~~
另外不知道我的帖子有没有重复，但这是我自己做的实验，有自己碰到的问题，望大家帮帮小菜。。

1、染毒然后要离心去培养液，但我发现2000转并不能是细胞完全沉到板底，有些孔还是悬着？另外，大家是用什么方法除去培养液的？我发现如果直接倒或者用移液枪吸的话，都会有误差。

2、最后用酶标仪检测的波长是490nm还是570nm？参考波长是什么意思？

3、调零孔和对照孔的作用是什么？最后的结果怎么表示？

4、一般检测出来的OD值在什么范围比较可信？如果低了，是不是表示每孔加的细胞数太少了，一般一个空要多少个左右？

5、还有我的反应体积是100μL（培养基40+细胞悬液50+毒素10），有影响么？有些人用的是200μL。

6、MTT配置是，不用过滤关系大不大？

[ Last edited by hcming on 2010-9-13 at 18:31 ]
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1楼 2010-09-13 18:22:45
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sciencedj

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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scelab(金币+10):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-15 23:41:12
1.染毒后一般不离心，这样很麻烦，而且误差相比会更大。我们一般都是用枪吸，吸的时候要慢，注意下面的结晶紫！
2.对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm。
3.调零孔的作用是因为每一列的板子都存在误差，所以我们在每一列平行样的下面都设置一个调零孔，这样的话，用酶标仪测的时候，它就可以将你每一列的板子进行综合，这样做可以减少误差。
4.MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
5.只要MTT工作浓度为5 mg/ml，即0.5%MTT，反应体积是100还是200，应该无所谓，不过这样的话，你的细胞可能长得慢点，少点。
6.不过滤不行，MTT对细菌非常敏感，我刚做的时候，调零孔的吸光值都很大，后来我在显微镜下发现就是因为染菌，里面有紫色结晶。
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2楼2010-09-13 18:46:58
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hcming

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by sciencedj at 2010-09-13 18:46:58:
1.染毒后一般不离心，这样很麻烦，而且误差相比会更大。我们一般都是用枪吸，吸的时候要慢，注意下面的结晶紫！
2.对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm。
3. ...

谢谢您的回帖。

因为我做的是悬浮细胞，不离心怎么去培养液呢？还是计算好时间，比如染毒12小时，在8小时的时候直接加MTT，4小时后再离心加DMSO？
关于调零孔，就是设置一列设置5个平行，最下面设调零？
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3楼2010-09-13 19:17:02
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sciencedj

新虫 (初入文坛)
★
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恩，是的。调零孔就是里面除了不加细胞之外，其他的跟上面一样，是为了减少板子之间的误差的。而对照孔就是里面只加细胞，不加染毒剂的。
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4楼2010-09-15 20:53:08
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)

自由人，我型我秀！

优秀版主
楼主的离心机不错，应该是离板的那种。
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人生不过几十年，成败荣辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快乐最值钱，自古人间苦无边，看得高远境如仙，愿你不为凡事恼，轻松快乐每一天。
5楼2010-09-15 22:40:14
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hcming

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dhd997 at 2010-09-15 22:40:14:
楼主的离心机不错，应该是离板的那种。

呵呵，恩，还行，就是特别的敏感，要十分对称才能离的起来。
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6楼2010-09-16 08:16:04
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fl378

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by sciencedj at 2010-09-13 18:46:58:
1.染毒后一般不离心，这样很麻烦，而且误差相比会更大。我们一般都是用枪吸，吸的时候要慢，注意下面的结晶紫！
2.对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm。
3. ...

边缘孔用无菌PBS填充是什么意思呢？为什么要这样做？我也即将做MTT啦，呵呵，多谢赐教啊！
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7楼2010-10-25 20:58:40
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fl378

银虫 (小有名气)
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Originally posted by hcming at 2010-09-13 19:17:02:


谢谢您的回帖。

因为我做的是悬浮细胞，不离心怎么去培养液呢？还是计算好时间，比如染毒12小时，在8小时的时候直接加MTT，4小时后再离心加DMSO？
关于调零孔，就是设置一列设置5个平行，最下面设调零？

MTT反应的四个小时也算在染毒时间之内了？
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8楼2010-10-25 21:26:14
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味蕾瘦

铜虫 (初入文坛)
★
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我看我师兄他们用SDS终止反应就可以直接倒掉培养液，这是淋巴细胞就不悬浮了。
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青春就是疯狂的奔跑，然后华丽的跌倒。。。。
9楼2012-10-26 00:50:37
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河水流云

木虫 (正式写手)
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2楼: Originally posted by sciencedj at 2010-09-13 18:46:58
1.染毒后一般不离心，这样很麻烦，而且误差相比会更大。我们一般都是用枪吸，吸的时候要慢，注意下面的结晶紫！
2.对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm。
3.调 ...

您好，你的回答很详细，但第一点中关于洗去上清液我有个疑问，您说在吸取上清液时要注意结晶紫，难道在加MTT之前不用将原培养基除去吗，所以楼主这边说的这个吸取上清液时应该是还没有加MTT，从而不存在地下有结晶紫。不知道是不是这样的，请您指教
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10楼2013-10-25 10:36:00
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