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塞外雨

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】点突变已有9人参与

我想对已构建好的质粒进行点突变,突变点已经设计到引物上,用普通的taq酶P,再用Dpn I消化,直接转化,能行吗?还是 必须用Pfu酶P,才行。
主要就是taq在3端加了一个A
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
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snowice

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
scelab:KOD plus,有这么好吗? 2010-09-06 23:52:30
不是加不加a的问题,taq突变太高啊,pfu也不值得信任,拿去测序发现有问题多得不偿失啊,推荐用KOD plus,10K都没啥问题
爱吃爱睡懒得要死的猪头
2楼2010-09-06 13:08:02
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evan1987

铜虫 (小有名气)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-09-06 23:52:36
pfu足够了,消化后把目的基因酶切下来再重新连接,这样比较省钱啊。
3楼2010-09-06 23:07:30
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snowice

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
pfu的保证性还行,但也比KOD差不少,最主要它扩增能力不好
ps:为啥还要消化后酶切再连接啊,消化完直接转化不就完了?
引用回帖:
Originally posted by evan1987 at 2010-09-06 23:07:30:
pfu足够了,消化后把目的基因酶切下来再重新连接,这样比较省钱啊。

爱吃爱睡懒得要死的猪头
4楼2010-09-07 00:09:22
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塞外雨

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by snowice at 2010-09-07 00:09:22:
pfu的保证性还行,但也比KOD差不少,最主要它扩增能力不好
ps:为啥还要消化后酶切再连接啊,消化完直接转化不就完了?

怎么消化啊?没有看懂
只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
5楼2010-09-07 09:33:27
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
楼主搞错了一个问题。PFU足够,Taq肯定不能用。
你设计引物P出来的是你的基因片段,在消化模板后,直接转化怎么行?得酶切链接后转化。
仕不可不弘毅,任重而道远
6楼2010-09-07 10:07:21
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silicare(金币-1):纯表情 2010-09-07 11:49:42
7楼2010-09-07 10:22:05
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evan1987

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
为了保真,建议是把目的片段酶切下来再连接载体。毕竟载体很大,P的时候可能会有错误。
8楼2010-09-07 11:07:14
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snowice

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=9828804pt78r0u55dd9dcnk
建议你看一下点突变的protocol,是在已经建好的载体上进行点突变pcr,pcr产物是突变后的线性载体,用Dpn1把未突变的模板质粒消化掉直接转化就行了
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2366651
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-09-07 10:07:21:
楼主搞错了一个问题。PFU足够,Taq肯定不能用。
你设计引物P出来的是你的基因片段,在消化模板后,直接转化怎么行?得酶切链接后转化。

爱吃爱睡懒得要死的猪头
9楼2010-09-07 16:11:33
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
内容已删除
仕不可不弘毅,任重而道远
10楼2010-09-08 09:13:45
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