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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】点突变
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塞外雨

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】点突变 已有9人参与

我想对已构建好的质粒进行点突变，突变点已经设计到引物上，用普通的taq酶P，再用Dpn I消化，直接转化，能行吗？还是 必须用Pfu酶P，才行。
主要就是ｔａｑ在３端加了一个Ａ
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
1楼 2010-09-06 10:17:11
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snowice

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab:KOD plus，有这么好吗？ 2010-09-06 23:52:30
不是加不加a的问题，taq突变太高啊，pfu也不值得信任，拿去测序发现有问题多得不偿失啊，推荐用KOD plus，10K都没啥问题
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爱吃爱睡懒得要死的猪头
2楼2010-09-06 13:08:02
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evan1987

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-09-06 23:52:36
pfu足够了，消化后把目的基因酶切下来再重新连接，这样比较省钱啊。
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3楼2010-09-06 23:07:30
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snowice

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
pfu的保证性还行，但也比KOD差不少，最主要它扩增能力不好
ps：为啥还要消化后酶切再连接啊，消化完直接转化不就完了？
引用回帖:
Originally posted by evan1987 at 2010-09-06 23:07:30:
pfu足够了，消化后把目的基因酶切下来再重新连接，这样比较省钱啊。

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爱吃爱睡懒得要死的猪头
4楼2010-09-07 00:09:22
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塞外雨

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by snowice at 2010-09-07 00:09:22:
pfu的保证性还行，但也比KOD差不少，最主要它扩增能力不好
ps：为啥还要消化后酶切再连接啊，消化完直接转化不就完了？

怎么消化啊？没有看懂
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
5楼2010-09-07 09:33:27
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
★
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楼主搞错了一个问题。PFU足够，Taq肯定不能用。
你设计引物P出来的是你的基因片段，在消化模板后，直接转化怎么行？得酶切链接后转化。
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仕不可不弘毅，任重而道远
6楼2010-09-07 10:07:21
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wangyan1986626
★
silicare(金币-1):纯表情 2010-09-07 11:49:42
7楼2010-09-07 10:22:05
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evan1987

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
为了保真，建议是把目的片段酶切下来再连接载体。毕竟载体很大，P的时候可能会有错误。
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8楼2010-09-07 11:07:14
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snowice

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=9828804pt78r0u55dd9dcnk
建议你看一下点突变的protocol，是在已经建好的载体上进行点突变pcr，pcr产物是突变后的线性载体，用Dpn1把未突变的模板质粒消化掉直接转化就行了
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2366651
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-09-07 10:07:21:
楼主搞错了一个问题。PFU足够，Taq肯定不能用。
你设计引物P出来的是你的基因片段，在消化模板后，直接转化怎么行？得酶切链接后转化。

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爱吃爱睡懒得要死的猪头
9楼2010-09-07 16:11:33
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
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仕不可不弘毅，任重而道远
10楼2010-09-08 09:13:45
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