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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】原代细胞的分离与纯化培养
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dabizi_911

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】原代细胞的分离与纯化培养

咱们原代细胞从动物体中分离，有没有什么技巧呢，分离后纯化单一的细胞有什么好的技巧没，希望大伙多多说一下自己的观点，我以后也是做细胞的。谢谢
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1楼 2010-08-18 01:01:12
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
dabizi_911(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+3):鼓励交流，欢迎常来~~ 2010-08-22 09:10:41
1、预先高压消毒所需要的器材
2、取完新鲜组织后要用冰冷充分洗涤洗掉杂细胞，分离也要尽量挑除血管等。不过也不要搞太久，否则分出来的细胞活力很差
3、胶原酶比胰酶更适合消化组织，消化时间和强度就要自己摸索
4、建议在胶原酶快消化结束之前加DNase I，这样细胞会更加分散，过筛子的时候更好过，分出来的细胞量更大
5、种板两天之内不要去碰他，加1.5~2倍双抗养着。两天后第一次换液的时候小心点，慢慢摇晃摇掉杂细胞。后续的换液也同样操作，视情况可以冲洗，
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6楼2010-08-18 09:31:39
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sandra2128

金虫 (小有名气)
★ ★
dabizi_911(金币+1):谢谢参与
看天(金币+1):鼓励一下 2010-08-20 22:53:32
1、无菌操作很重要。我平时是去下载组织后用75%酒精浸泡2-3min，然后用生理盐水洗15遍以上。
2、工具很重要。俗话说磨刀不误砍柴工，有好的工具在手，剥离或者切割就不会浪费很长时间，保证了整个分离过程的时长不会对细胞活性造成影响。
3、media很重要。事先把media准备好，分离出来后及时加上media，保证细胞活性。记得加pen/strep。原代时可适量加倍。
4、按时换液。原代及时换液可以防止污染。
暂时就能总结这么多了。以后想起来再补充吧
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静而后能安；安而后能思；思而后能得。
2楼2010-08-18 02:43:33
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mafang68

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
dabizi_911(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+2):新虫，鼓励交流~~ 2010-08-22 09:09:58
1 提取时速度要快，提前把材料准备好，想周全，做实验时拿来就用，不要现找
2 保证无菌，分离时可加双抗；PBS里还可以加上血清，保证细胞状态好
3 分离后的细胞要纯化，可通过不同群的细胞是否贴壁等简单纯化；要想纯度高，可用磁珠分选，不过价格高
4 一些细胞要保持活性需在培养时加入细胞因子。我分离的淋巴细胞就需要IL-2；树突状细胞则需加GM-CSF和IL-4
知道的就这么些了
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木虫啦，哈哈
3楼2010-08-18 08:51:31
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夜龙舞

金虫 (小有名气)
★
dabizi_911(金币+1):谢谢参与
原代细胞培养是组织消化后细胞量非常巨大，一般要计数后再放进方瓶内培养，但是都嫌麻烦不怎么做，这是要取舍，舍弃一定量的单细胞悬液，而且原代细胞要传几代稳定了再做实验。只要严格细胞操作技术规范，一般没有问题。
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4楼2010-08-18 09:01:00
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