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【求助/交流】农杆菌转真菌的问题已有14人参与
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在做尖孢镰刀菌的农杆菌转化，都做了几个月了，都没转进去，转化体系都没建好，后面的基因敲除要来不及做了，毕不了业了~ 想请教高手们几个问题： 1.AS（乙酰丁香酮）是不是很容易失效？比如在光照时或者反复冻融时？ 2 .配置MM或IM培养基时CaCl2能不能和培养基一起灭菌？FeSO4.7H2O呢？ 3.配置IM时MES能不能和培养基一起灭菌？（不能的话有要求配成多少倍的母液？）MES配置时一定调PH值至5.5吗？ 4.共培养后滤膜上农杆菌的背景很强，长的厚厚的糊糊的一片，都没看到菌丝，请问可能的原因？（6小时诱导后，共培养前，农杆菌的浓度降到OD600=0.15左右,应该比较低了吧？培养温度也降到25度了） 5.有看到文献上有说明固体的IM培养基的葡萄糖要减半(比液体IM，MM的葡萄糖用量少一半)，为什么呀？有些文献又没有特别注明要减半~ 6.共培养后将滤膜转到筛选培养基上时是反过来帖还是正着帖呀？(不同的文献说的都不一样) 7.转化时有没有什么特别要注意的操作呀？ 有没有人做过相关研究呀？或者比较了解相关方面的~交流下吧~ 附：MM培养基K2HPO4 2.05g，KH2PO4 1.45g，NaCl 0.15g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.067g，FeSO4·7H2O 0.0025g， (NH4)2SO4 0.5g， glucose 2.0g，去离子水 1000mL。 113℃灭菌30min。 IM 液体培养基： K2HPO4 2.05g， KH2PO4 1.45g， NaCl 0.15g， MgSO4.7H2O 0.5g， CaCl2·2H2O 0.067g，FeSO4·7H2O 0.0025g，(NH4)2SO4 0.5g，glucose 2.0g，MES 8.54g，AS 200uM（2µL/mL, 母液为 100 uM） ，甘油 5g，去离子水 1000mL。113℃灭菌 30min。 （固体培养基加琼脂粉 20g） [ Last edited by yangyang.214 on 2010-5-30 at 19:40 ] |
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3楼2010-05-30 21:25:08
Petter_JDW
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MES配成 1M母液 pH5.5 过滤灭菌~MM培养基灭菌后 冷却和平时加抗生素的温度~加入As和Mes （都不能高压灭菌）调节pH至5.0~6.0间~不同菌株对pH要求不同 总体在5 6之间~ 高于6农工杆菌长的很快 影响筛选 我一般把MgSO4·7H2O ，CaCl2·2H2O 单独配成母液，不然会很浑浊~ 文献大多说共培养时Glucose要减半至5 mM~筛选时反扣膜两天后揭去~确实 有时候也会菌体过多影响筛选~所以我也实验用液体共培养 那样操作跟方便 不用转膜 也不会出现农杆菌非常多~ |
8楼2011-08-22 20:56:50
ben1147
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5楼2010-05-30 22:43:07
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1.我看有的文献说AS配好以后放到-20度保存是可以的，有的则说要现配先用，总之它的半衰期比较短，越新鲜越好吧 2. 我的CaCl2也是单独配的，FeSO4.7H2O是放在一起灭的，以前没考虑到它会被氧化呢！ 3 MES我都是配成0.5M，用NaOH调pH到5.3，放四度冰箱保存，有一次暑假假期回家前忘了放冰箱，结果回来一看已经变黄了。 4. 我以前也出现过这种情况，共培养后再转到含有300uM头孢噻肟的培养基上时，农杆菌还是疯长（而之前做抗性梯度实验室，200uM的头孢噻肟就可以抑制农杆菌的生长），有一次看到一篇文献说如果单位面积的农杆菌浓度过大的话，会抑制不住的，后来我使用的浓度都达到500-600，抑制效果挺好的。 5 我的是减半的，我估计是怕农杆菌或真菌疯长吧。 6 我都试过，还有的说把膜上的共培养物洗下来再接到帅选培养基上。 |
9楼2011-10-26 16:14:18
2楼2010-05-30 21:24:22
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