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【求助/交流】农杆菌转真菌的问题已有14人参与
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在做尖孢镰刀菌的农杆菌转化，都做了几个月了，都没转进去，转化体系都没建好，后面的基因敲除要来不及做了，毕不了业了~ 想请教高手们几个问题： 1.AS（乙酰丁香酮）是不是很容易失效？比如在光照时或者反复冻融时？ 2 .配置MM或IM培养基时CaCl2能不能和培养基一起灭菌？FeSO4.7H2O呢？ 3.配置IM时MES能不能和培养基一起灭菌？（不能的话有要求配成多少倍的母液？）MES配置时一定调PH值至5.5吗？ 4.共培养后滤膜上农杆菌的背景很强，长的厚厚的糊糊的一片，都没看到菌丝，请问可能的原因？（6小时诱导后，共培养前，农杆菌的浓度降到OD600=0.15左右,应该比较低了吧？培养温度也降到25度了） 5.有看到文献上有说明固体的IM培养基的葡萄糖要减半(比液体IM，MM的葡萄糖用量少一半)，为什么呀？有些文献又没有特别注明要减半~ 6.共培养后将滤膜转到筛选培养基上时是反过来帖还是正着帖呀？(不同的文献说的都不一样) 7.转化时有没有什么特别要注意的操作呀？ 有没有人做过相关研究呀？或者比较了解相关方面的~交流下吧~ 附：MM培养基K2HPO4 2.05g，KH2PO4 1.45g，NaCl 0.15g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.067g，FeSO4·7H2O 0.0025g， (NH4)2SO4 0.5g， glucose 2.0g，去离子水 1000mL。 113℃灭菌30min。 IM 液体培养基： K2HPO4 2.05g， KH2PO4 1.45g， NaCl 0.15g， MgSO4.7H2O 0.5g， CaCl2·2H2O 0.067g，FeSO4·7H2O 0.0025g，(NH4)2SO4 0.5g，glucose 2.0g，MES 8.54g，AS 200uM（2µL/mL, 母液为 100 uM） ，甘油 5g，去离子水 1000mL。113℃灭菌 30min。 （固体培养基加琼脂粉 20g） [ Last edited by yangyang.214 on 2010-5-30 at 19:40 ] |
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