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【求助/交流】生物小实验求助 已有3人参与
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| 请问，我要筛8个物种的SSR引物通用性及多态性。我现在打算先随机拿一个物种出来进行初筛，然后分析这个物种的引物在其他物种中的通用性。那我PCR的时候，每个PCR体系和程序会要变吗？每一个都要优化吗？还有聚丙烯酰胺的电泳图怎么看呢？怎么分析多态性呢？非常之感谢啊 |
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liyong1981 
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liyong1981
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yujiaping1
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scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-30 21:19:32
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我觉得你现在这个实验设计的就有点问题，你不能拿其中一个物种来初筛，这样很有可能，原本在其他物种中可以成功扩增的引物，因为在这个物种中无法扩增而被你抛弃。 所以，我认为目前最合理的方法是将八个物种的DNA混合，获得基因池，用基因池来筛选引物，这样就不会出现漏掉某个引物的情况了。 PCR体系对于微卫星来说，使用酶说明书的肯定没有任何问题，基本不需要调整 PCR程序需要优化，退火温度需要调整，每个引物都有自己特异的温度，这是做微卫星相对麻烦的地方，如果你的PCR仪带梯度，相对就简单一些。建议你做降落PCR，5度一筛基本上该能跑出来的都应该能跑出来，会简便很多 筛选微卫星引物的原则： 1、目的大小处，有一条或两条带就算相对较好的引物（没有杂带最好，如果杂带相距较远，也可以忽略） 2、没有扩增出条带的引物，降低退火温度，如果温度已降至45度以下仍无法成功扩增该位点，抛弃该引物，如果还想获得该位点，就需要重新设计引物 3、扩增条带模糊或者较浅的引物，稍微降低退火温度即可 4、扩增出现杂带的引物，适当升高退火温度 5、如果所有个体都出相同的一条带，被视为无多态性的位点，通常抛弃该位点（当然，不同的实验目的可能没有多态的位点也是有意义的） [ Last edited by yujiaping1 on 2010-5-30 at 21:22 ] |
6楼2010-05-30 17:58:23
