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铜虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】RT-PCR 已有4人参与

大家做RT-PCR时，RNA加多少？CDNA加多少呀？最近做RT-PCR，结果老是不很理想，P出来的条带不亮，不知道是哪出了问题，请高手们指点一下

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1楼 2010-05-19 17:31:47

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zhwenxing

木虫 (著名写手)

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2):很热心很细致 2010-05-19 18:44:18

烦请楼主将问题说得清楚一些，具体的实验步骤如何做的，大家才能各抒己见哈。O(∩_∩)O哈哈~

1、您是一步法还是两步法？一步法的话，考虑RNA的纯度问题，还有反应体系的精确性。两步法的话，先反转录，根据不同的逆转录酶的要求去考量RNA的用量。

2、如果您用的是总RNA的话，比如promega的m-mlv，那么，25ul的反应体系，需要加入量为2-3ug，酶的用量为200U，如果用AMV的话，需要25U就足够了，但是其内切酶活性等均会升高。自己根据酶的性质来确定。

3、如果用mRNA作为反转录的模板会好很多，不知您是否需要纯化mRNA。

4、扩增如Actin之类的基因检测反转录的结果并不能准确的定量反转录的效率。

……