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bear2007

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yangbing1882(金币+10, 博学EPI+1): 2010-05-04 19:02:15

可以参照这种方法：https://www.tcmtcm.com/OPC/3.htm

蚕豆皮中原花青素提取的工艺研究
1．2 试药、试剂蚕豆皮(粉碎至粒度为4O目，放人广口瓶备用)；儿茶素对照品(中国药品生物制品检定所，批号 110878—200102)。甲醇、乙醇、丙酮、硫酸、香草醛，均为分析纯。

2 实验方法

2．1 蚕豆皮中原花青素的提取方法准确称取粉碎后的蚕豆皮5．0 g于150 mL圆底烧瓶中，在一定料液比、溶剂浓度、微波功率条件下提取一定时间，取出过滤，将滤液减压浓缩，测定原花青素的含量。本文中以百分含量表示，即每100 g蚕豆皮经提取得到的原花青素的量。

2．2 原花青素含量的测定原花青素由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，最简单的原花青素是儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体、直至十聚体等等。国际通用的原花青素的分析方法是分光光度法，本文选用香草醛检测法。原花青素的显色机理与儿茶素相似，在酸性条件下，原花青素组成单元儿茶素的A环化学活性较高，其上的羟基可以和香草醛发生缩合反应，在浓酸作用下形成的产物变为有色的正离子，由于香草醛和多酚类物质的一对一的特异结合，根据此正碳离子吸光度可测定出原花青素含量。此法具有操作简单、重现性好、线性范围宽的优点，目前普遍用于测定原花青素的含量。

2．2．1 标准曲线的绘制

1)溶液配制

儿茶素标准液：准确称取儿茶素标准品(65℃真空干燥至恒重)，用50％甲醇制成浓度分别为0．04、0．08、0．12、 0．16、0．20 mg／mL的溶液作为标准溶液；30 g／L香草醛溶液：30 g香草醛溶于1000 mL甲醇中；30％硫酸溶液：30 mL 硫酸(95％～98％)+70 mL甲醇混合均匀。

2)标准曲线

分别准确移取不同浓度的儿茶素标准溶液各0．5 mL 于10 mL具塞比色管中，加入2．5 mL 30 s／L香草醛溶液，然后加入2．0 mL 30％硫酸溶液，30％条件下避光反应20 rain，以试剂溶液为空白，在500 nm处测定吸光度值，取标准液的浓度和吸光度数据经回归处理，回归方程Y=45．22x+ 0．001，r=0．9995。结果表明，儿茶素浓度在0．OO4～ O．02mg／mL范围内具良好的线性关系。

2．2．2 原花青素含量测定l j 将浓缩液加50％甲醇定容至25mL量瓶中，取上述溶液l mL，用50％甲醇定容至25 mL作为样品溶液；准确量取0．5 mL样品溶液，按照上述标准曲线方法进行测定，加入2．5 mL 30 g／L香草醛溶液，然后加入2．5 mL 30％硫酸溶液，30％条件下避光反应20 min，以样品溶液为空白，即0．5 mL样品溶液+2．5 mL甲醇+2．0mL 30％硫酸溶液，在500 nm 处测定吸光度值。

2．2．3 方法学考察

1)精密度实验精密吸取样品溶液0．5 mL，于25 mL 量瓶中，重复测定5次，得RSD为0．92％。2)稳定性试验精密吸取同一样品溶液0．5 mL于25 mL量瓶中，照“2．2．2” 项下操作，分别于显色后l、2、3、4、5h在500 nm处测定吸光度，结果RSD为1．27％，表明供试品溶液中原花青素在测定的5 h内可保持稳定。

2．2．4 加样回收率试验精密称取已知含量的样品5份，分别加入一定量的儿茶素标准溶液适量，按样品原花青素的提取方法提取后，照“2．2．2”项下操作，在500 nm处测定吸光度并计算回收率，结果平均回收率为96．86％，RSD为 1．82％。

2．2．5 工艺优化方法采用单因素试验法，对提取溶剂、提取溶剂浓度、浸泡时间、料液比、微波功率等进行初步考察，根据单因素试验结果确定正交试验的因素水平，优选蚕豆皮中原花青素的最佳微波提取工艺。

3 结果与分析

3．1 单因素试验

3．1．1 提取溶剂的影响

在相同的微波提取条件下，选用相同浓度的乙醇、甲醇、丙酮和蒸馏水进行提取，确定最佳提取溶剂，结果见图1。由图1显示，采用蒸馏水提取的效果较差，乙醇的提取效果优于甲醇、丙酮。甲醇、丙酮均有一定毒性，不适宜应用于食品工业生产。因此，本实验选择乙醇作为最佳的提取溶剂。

3．1．2 溶剂浓度的影响

准确称取蚕豆皮5．0 g 5份，分别用30％、40％、50％、 60％、70％乙醇50mL浸泡1h，微波功率400W 辐射10rain，考察溶剂浓度对提取结果的影响。

由图2可见，乙醇浓度达到50％时，原花青素的提取量最高，再升高乙醇浓度原花青素提取量已略有下降的趋势，原因是随着乙醇浓度的增大，使一些脂溶性物质的溶出增加。因此确定乙醇浓度50％时为提取效果最佳点。

3．1．3 浸泡时间的影响

精密称取蚕豆皮5．0 g 5份于150 mL圆底烧瓶中，各加入50％的乙醇溶液50 mL，分别浸泡0．5、1、2、3、4h后微波功率400W 辐射10min，考察浸泡时间对提取结果的影响.

由图3可知，在2 h以前，原花青素提取率随着浸泡时间的增长而增大，2 h后随时间的增长而略有减少。由于原花青素单元中含有多个羟基，在长时间浸泡过程中可能会弓l起其结构的变化，如氧化等。所以考虑到实验结果和实际成本，本文选择浸泡时间2 h。

3．1．4 料液比的影响

准确称取蚕豆皮5．0g 5份，分别加入50％乙醇25、50、 75、100、125mL浸泡2h，微波功率400W 辐射10min，考察料液比对提取结果的影响。

由图4可知，当料液比达到1：10后，再增大料液比，提取率趋于稳定，即_定比例的溶剂已将有效成份基本溶出完全，且过大的料液比会造成溶剂和能源的浪费，并给后面的浓缩带来困难。所以用50％乙醇溶液浸泡时的最佳料液比为1：10。

3．1．5 微波功率的影响

准确称取蚕豆皮5．0g 5份，加入50mL 50％乙醇室温的条件下浸泡2h，于100、200、400、600和800W 功率下加热 10min；考察微波功率对提取结果的影响。

由图5可知，随着微波功率的增加，原花青素提取量呈上升再下降趋势，当功率为400W 时，原花青素提取率最高，曲线达到最高点。微波功率过高，一些活性成分会被破坏。

3．2 正交实验

3．2．1 正交试验设计为优选出醇提的最佳工艺条件，在上述单因素试验所得数据的基础上，用L9(34)正交表，以原花青素得率为评价指标，对影响原花青素提取效果的因素：微波功率、乙醇浓度、提取时间等因素进行考察，因素水平见表1，试验安排见表2。

3．2．2 正交试验结果精密称取蚕豆皮5．Og 9份，按表2 安排提取，按2．2．2项下方法制备样品溶液并测定原花青素含量，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

方差分析表明，因素的重要性依次为C>B>A，微波功率和料液比对原花青素的提取有显著影响，提取时间有一定影响。优选出的工艺为：A2B2C3，即提取时间10min，微波功率400W，料液比为1：15。

3．3 提取次数的确定

分别取5．0g药粉，在上述已选取的最佳提取条件下，连续提取5次，结果如图6所示。

由图6可知，随着提取次数增加，原花青素的提取量累计增加。当提取次数大于3时，曲线趋势已接近平缓，即原花青素提取量的增加已不明显。从节省溶剂和时间考虑，确定提取次数为3次。

3．4 验证试验

在选取的最佳提取条件下，对蚕豆皮中原花青素连续提取3次，测定，得原花青素含量为2．32％(RSD=1．2％， = 3)。

4 讨论

4．1 本实验研究了微波法提取蚕豆皮中原花青素的工艺条件，考察了微波输出功率、溶剂浓度、微波加热时间、料液比等重要工艺参数对原花青素收率的影响，微波法提取蚕豆皮中原花青素的最佳生产工艺条件为：使用50％乙醇，按料液比1：15将料液混合，在微波输出功率400W下，持续加热10 min，提取3次，100 g蚕豆皮经微波提取可得到 42．2 g粗提物，原花青素得率2．32％。由于粗提物中仍含有一些水溶性大分子的杂质如果胶和糖类，还有鞣质、有机酸等，它们会影响到蚕豆皮中原花青素的精制，故今后需要对其中原花青素的分离纯化做进一步的研究。

4．2 微波法是一种以溶液内的分子、离子接受微波辐射获得能量而迅速升温的加热方式，具有快速加热的优点，减少了有效成分在高温下的受热时间，对于热敏性物质的提取是十分有利的，且符合社会的节能环保要求。

4．3 本研究为产业化生产蚕豆原花青素提供了技术支撑，对蚕豆的深层次开发利用创造了十分有利的条件。

[ Last edited by bear2007 on 2010-5-4 at 13:33 ]