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peilin木虫 (正式写手)
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[求助]
关于弹性酶效价测定的稀释倍数问题~求助各位大神！
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最近在做弹性酶的效价测定，标准如下： 【效价测定】 对照品溶液的制备 精密称取刚果红－弹性蛋白100mg，置100ml量瓶中，加入对照用弹性酶溶液20ml，置37℃水浴中不断振摇至全部溶解，加入磷酸盐缓冲液（pH6.0）50ml， 并用硼酸盐缓冲液（pH8.8）稀释至刻度。 供试品溶液的制备 取本品适量，精密称定，置研钵中，加少量硼酸盐缓冲液(pH8.8)及氢氧化钠液(0.1mol/L)约4滴，研磨使溶解，移至100ml量瓶中，用硼酸盐缓冲液(pH8.8)稀释至刻度。使成每1ml中约含弹性酶8个单位。 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0与10.0ml,分别加硼酸盐缓冲液（pH8.8）与磷酸盐缓冲液（pH6.0）的混合液(1：1)至10ml，以零管为空白,照分光光度法（中国药典1985年版二部附录20页）,在495nm的波长处测定吸收度。以底物量为横座标，吸收度为纵座标，绘制标准曲线。 测定法 取直径约20mm的试管3支，分别加入刚果红-弹性蛋白20mg，加硼酸盐缓冲液（pH8.8）3.0ml,置37℃水浴中预热10分钟，依次在第一管内加入硼酸盐缓冲液（pH8.8)2.0ml,第 2、3管内各加入预热到37℃的供试品溶液2.0ml，计时，置37℃水浴中连续振摇20分钟（准确计时），加入磷酸盐缓冲液（pH6.0）5.0ml，摇匀，以 2,500转／分离心20分钟，精密吸取上清液2.0ml，加入硼酸盐缓冲液（pH8.8）和磷酸盐缓冲液（pH6.0）的混合液(1：1)至4.0ml,以第一管为空白，照分光光度法，在495nm的波长处测定吸收度。从标准曲线上查得相应的底物量,按单位定义折算成活力单位数计算。 在上述条件下， 20分钟水解1mg刚果红－弹性蛋白所需的酶量为一个弹性酶活力单位。 现在我标准曲线已经做出来了，供试品的吸光度也有，因此可以得出相应消耗底物的量C。但是在计算时有些疑惑。 我觉得供试品的效价U=C*稀释体积*反应体系总体积/反应酶液体积，这样求得供试品效价U=C*10.算到这一步，就开始疑惑了，我要求出供试品的酶活，供试品重量是0.2g，试验称量0.15g，那供试品的酶活应该是U*100*0.2/0.15还是U*100/2*0.2/0.15？100是供试品的总体积，我个人觉得求出的U是单位酶活，也就是每1ml的酶活，所以直接乘以100就可以了，不知道对不对。求助各位了。万分感谢！  |
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崇明先生
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根据底物质量和吸光度，得到标准曲线。根据标准曲线，求出样品消耗的底物，根据酶活力单位的定义，算出2毫升供试品中的酶单位，再根据稀释倍数计算供试品的总酶单位，除以供试品质量就计算出每毫克样品里面的酶单位了。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2019-04-23 16:59:43
