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peilin木虫 (正式写手)
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[求助]
关于弹性酶效价测定的稀释倍数问题~求助各位大神!
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最近在做弹性酶的效价测定,标准如下: 【效价测定】 对照品溶液的制备 精密称取刚果红-弹性蛋白100mg,置100ml量瓶中,加入对照用弹性酶溶液20ml,置37℃水浴中不断振摇至全部溶解,加入磷酸盐缓冲液(pH6.0)50ml, 并用硼酸盐缓冲液(pH8.8)稀释至刻度。 供试品溶液的制备 取本品适量,精密称定,置研钵中,加少量硼酸盐缓冲液(pH8.8)及氢氧化钠液(0.1mol/L)约4滴,研磨使溶解,移至100ml量瓶中,用硼酸盐缓冲液(pH8.8)稀释至刻度。使成每1ml中约含弹性酶8个单位。 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0与10.0ml,分别加硼酸盐缓冲液(pH8.8)与磷酸盐缓冲液(pH6.0)的混合液(1:1)至10ml,以零管为空白,照分光光度法(中国药典1985年版二部附录20页),在495nm的波长处测定吸收度。以底物量为横座标,吸收度为纵座标,绘制标准曲线。 测定法 取直径约20mm的试管3支,分别加入刚果红-弹性蛋白20mg,加硼酸盐缓冲液(pH8.8)3.0ml,置37℃水浴中预热10分钟,依次在第一管内加入硼酸盐缓冲液(pH8.8)2.0ml,第 2、3管内各加入预热到37℃的供试品溶液2.0ml,计时,置37℃水浴中连续振摇20分钟(准确计时),加入磷酸盐缓冲液(pH6.0)5.0ml,摇匀,以 2,500转/分离心20分钟,精密吸取上清液2.0ml,加入硼酸盐缓冲液(pH8.8)和磷酸盐缓冲液(pH6.0)的混合液(1:1)至4.0ml,以第一管为空白,照分光光度法,在495nm的波长处测定吸收度。从标准曲线上查得相应的底物量,按单位定义折算成活力单位数计算。 在上述条件下, 20分钟水解1mg刚果红-弹性蛋白所需的酶量为一个弹性酶活力单位。 现在我标准曲线已经做出来了,供试品的吸光度也有,因此可以得出相应消耗底物的量C。但是在计算时有些疑惑。 我觉得供试品的效价U=C*稀释体积*反应体系总体积/反应酶液体积,这样求得供试品效价U=C*10.算到这一步,就开始疑惑了,我要求出供试品的酶活,供试品重量是0.2g,试验称量0.15g,那供试品的酶活应该是U*100*0.2/0.15还是U*100/2*0.2/0.15?100是供试品的总体积,我个人觉得求出的U是单位酶活,也就是每1ml的酶活,所以直接乘以100就可以了,不知道对不对。求助各位了。万分感谢! |
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根据底物质量和吸光度,得到标准曲线。根据标准曲线,求出样品消耗的底物,根据酶活力单位的定义,算出2毫升供试品中的酶单位,再根据稀释倍数计算供试品的总酶单位,除以供试品质量就计算出每毫克样品里面的酶单位了。 发自小木虫Android客户端 |

2楼2019-04-23 16:59:43














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