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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】ELISA实验结果全阳性？？
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吓猴蹲

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】ELISA实验结果全阳性？？ 已有5人参与

原理：
以多聚酪氨酸多肽为底物，在ATP存在条件下，用提取的酪氨酸激酶催化底物酪氨酸的磷酸化，用酶标记的单克隆抗体检测酪氨酸磷酸化程度，以OPD做为辣根过氧化物酶底物显色。

实验过程中，设置酶浓度固定，ATP浓度递减，想寻找最适ATP浓度，但是结果发现不同ATP对应的OD值相同，无梯度变化，请教各位，什么原因呢？

本考虑是否因为酶的浓度太低，ATP均过量导致此结果，但未加ATP的孔应该不发生反应，且OD值也应该很低才对啊，不知道为什么OD值这么高呢，请各位指点指点，谢谢！附上数据。
ATP浓度                       OD值
100uM                                 2.611
10                                 2.173
5                                 1.944
2.5                                 2.063
1.25                                2.128
0.625                                2.122
0                                2.326
100uMATP,不加酶            0.189
不加ATP和酶            0.215
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一分一分，省到结婚
1楼 2010-04-29 18:23:40
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plantaqp

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+2):good 2010-04-29 23:52
每个浓度只有一个OD值？每个浓度也要有梯度的，因为Elisa实验的viaribility 是比较大的。实验没有重复很难讲的。如果你是多组实验的均值，那么就可能是ATP浓度浓度太高了。

[ Last edited by plantaqp on 2010-4-29 at 19:02 ]
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2楼2010-04-29 18:59:14
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yunaitong

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是你血清浓度没有稀释的问题吧~~
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3楼2010-04-29 19:32:19
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吓猴蹲

木虫 (正式写手)
我也考虑过可能是ATP过量的问题，但不加ATP加酶的孔OD值也很高，现在我们考虑是酶的非特异性吸附比较严重，后来实验发现酶的量变小，洗脱的时间延长可以稍微减少非特异性吸附，但如何避免出现非特异性吸附呢？有什么好的办法，请各位指点，谢谢！！！
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一分一分，省到结婚
4楼2010-05-12 15:18:55
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iamzhihui

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
洗版的时候要低浓度那头稍微向上倾斜，是不是在洗版的时候，高浓度的进入低浓度的孔里面了么？ELISA实验感觉细节挺重要的。
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5楼2010-05-13 10:14:02
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huangwensh

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主还在做ELISA吗？可否把您当年做的这个方法步骤分享一下？我不是很懂想学习学习！
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6楼2013-09-13 08:54:30
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