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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】转化失败
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 yinsongna 的 4 个金币

yinsongna

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】转化失败 已有10人参与

最近半个多月做的转化，板子都是干干净净，具体情况是：往载体上加基因，基因和载体都是进行双酶切，酶切位点是EcorI和SalI，用的fermentas的酶，原先是双酶切再连接，一直转化不成功，后来改为两次单酶切再连接，还是转化不成功。
原以为是没切开，但是进行但酶切的时候可以确定都切开了，连接用的solutionI 连接7h，转化之后还是不长，同时我用相同的感受态转其他质粒做对照，都能长出来，这也可以确定感受态没有问题，操作也没有问题。
转化十多遍了，现在想不出问题到底出在什么地方，跪请高手指点啊
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1楼 2010-04-13 20:01:03
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-14 00:20
yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:45
是不是抗生素的问题？种类和剂量都对么？
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2楼2010-04-13 22:19:41
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pidou213

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-14 00:20
yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:47
1、我觉得你酶切以后应该跑电泳看看切的如何？
2、涂板的技术也是一个问题，我有的时候就是把菌落全都涂在平板的边上了
3、转化的时间和温度，因该控制好
4、如楼上所说，筛选药剂的量和质量要控制好
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见得多爱的多
3楼2010-04-13 23:47:56
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w.king124

金虫 (正式写手)
yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:48
不是酶切回收的大片段和目的基因吗，我也是用这两个酶切的，很成功，做了两板，每板上都是长了很多，祝好运
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4楼2010-04-14 12:43:32
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yinsongna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wordsworth3180 at 2010-04-13 22:19:41:
是不是抗生素的问题？种类和剂量都对么？

抗生素是倒板子的时候直接加的，直接就是有抗生素的板子，做前面几个的时候都很正常
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5楼2010-04-14 12:45:03
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yinsongna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-04-13 23:47:56:
1、我觉得你酶切以后应该跑电泳看看切的如何？
2、涂板的技术也是一个问题，我有的时候就是把菌落全都涂在平板的边上了
3、转化的时间和温度，因该控制好
4、如楼上所说，筛选药剂的量和质量要控制好

单酶切电泳看是切的很完全的，涂板问题的话，我同时还涂了2个质粒作对照，但是我涂的对照板子都长的好好的啊，应该不是涂板的问题吧
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6楼2010-04-14 12:47:03
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yinsongna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by w.king124 at 2010-04-14 12:43:32:
不是酶切回收的大片段和目的基因吗，我也是用这两个酶切的，很成功，做了两板，每板上都是长了很多，祝好运

你用的哪家的酶啊 我后来做两次单酶切的时候都要切10h以上。。。。
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7楼2010-04-14 12:48:12
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gandalf886

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yinsongna at 2010-04-13 20:01:03:
最近半个多月做的转化，板子都是干干净净，具体情况是：往载体上加基因，基因和载体都是进行双酶切，酶切位点是EcorI和SalI，用的fermentas的酶，原先是双酶切再连接，一直转化不成功，后来改为两次单酶切再连接， ...

你这个两个酶切位点是不是挨着
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8楼2010-04-14 12:58:16
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liyong1981

金虫 (正式写手)
肯定是载体和你片段的比例问题，你可以多几种比例来连接～转化～个人经验～试剂的问题一般不会出，
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9楼2010-04-14 14:20:16
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lls850225

银虫 (小有名气)
加大片段的量试一试，我也据到过类似的~
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10楼2010-04-14 16:02:17
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