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yinsongna

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[交流] 【求助/交流】转化失败已有10人参与

最近半个多月做的转化，板子都是干干净净，具体情况是：往载体上加基因，基因和载体都是进行双酶切，酶切位点是EcorI和SalI，用的fermentas的酶，原先是双酶切再连接，一直转化不成功，后来改为两次单酶切再连接，还是转化不成功。
原以为是没切开，但是进行但酶切的时候可以确定都切开了，连接用的solutionI 连接7h，转化之后还是不长，同时我用相同的感受态转其他质粒做对照，都能长出来，这也可以确定感受态没有问题，操作也没有问题。
转化十多遍了，现在想不出问题到底出在什么地方，跪请高手指点啊

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1楼 2010-04-13 20:01:03

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wordsworth3180

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scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-14 00:20
yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:45

是不是抗生素的问题？种类和剂量都对么？

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2楼2010-04-13 22:19:41

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pidou213

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yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:47

1、我觉得你酶切以后应该跑电泳看看切的如何？
2、涂板的技术也是一个问题，我有的时候就是把菌落全都涂在平板的边上了
3、转化的时间和温度，因该控制好
4、如楼上所说，筛选药剂的量和质量要控制好

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见得多爱的多

3楼2010-04-13 23:47:56

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w.king124

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yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:48

不是酶切回收的大片段和目的基因吗，我也是用这两个酶切的，很成功，做了两板，每板上都是长了很多，祝好运

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4楼2010-04-14 12:43:32

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yinsongna

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Originally posted by wordsworth3180 at 2010-04-13 22:19:41:
是不是抗生素的问题？种类和剂量都对么？

抗生素是倒板子的时候直接加的，直接就是有抗生素的板子，做前面几个的时候都很正常

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5楼2010-04-14 12:45:03

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yinsongna

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Originally posted by pidou213 at 2010-04-13 23:47:56:
1、我觉得你酶切以后应该跑电泳看看切的如何？
2、涂板的技术也是一个问题，我有的时候就是把菌落全都涂在平板的边上了
3、转化的时间和温度，因该控制好
4、如楼上所说，筛选药剂的量和质量要控制好

单酶切电泳看是切的很完全的，涂板问题的话，我同时还涂了2个质粒作对照，但是我涂的对照板子都长的好好的啊，应该不是涂板的问题吧

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6楼2010-04-14 12:47:03

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yinsongna

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Originally posted by w.king124 at 2010-04-14 12:43:32:
不是酶切回收的大片段和目的基因吗，我也是用这两个酶切的，很成功，做了两板，每板上都是长了很多，祝好运

你用的哪家的酶啊我后来做两次单酶切的时候都要切10h以上。。。。

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7楼2010-04-14 12:48:12

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gandalf886

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Originally posted by yinsongna at 2010-04-13 20:01:03:
最近半个多月做的转化，板子都是干干净净，具体情况是：往载体上加基因，基因和载体都是进行双酶切，酶切位点是EcorI和SalI，用的fermentas的酶，原先是双酶切再连接，一直转化不成功，后来改为两次单酶切再连接， ...

你这个两个酶切位点是不是挨着

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8楼2010-04-14 12:58:16

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