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yinsongna

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】转化失败 已有10人参与

最近半个多月做的转化,板子都是干干净净,具体情况是:往载体上加基因,基因和载体都是进行双酶切,酶切位点是EcorI和SalI,用的fermentas的酶,原先是双酶切再连接,一直转化不成功,后来改为两次单酶切再连接,还是转化不成功。
原以为是没切开,但是进行但酶切的时候可以确定都切开了,连接用的solutionI 连接7h,转化之后还是不长,同时我用相同的感受态转其他质粒做对照,都能长出来,这也可以确定感受态没有问题,操作也没有问题。
转化十多遍了,现在想不出问题到底出在什么地方,跪请高手指点啊
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)


scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-14 00:20
yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:45
是不是抗生素的问题?种类和剂量都对么?
2楼2010-04-13 22:19:41
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pidou213

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-14 00:20
yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:47
1、我觉得你酶切以后应该跑电泳看看切的如何?
2、涂板的技术也是一个问题,我有的时候就是把菌落全都涂在平板的边上了
3、转化的时间和温度,因该控制好
4、如楼上所说,筛选药剂的量和质量要控制好
见得多爱的多
3楼2010-04-13 23:47:56
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w.king124

金虫 (正式写手)


yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:48
不是酶切回收的大片段和目的基因吗,我也是用这两个酶切的,很成功,做了两板,每板上都是长了很多,祝好运
4楼2010-04-14 12:43:32
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yinsongna

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by wordsworth3180 at 2010-04-13 22:19:41:
是不是抗生素的问题?种类和剂量都对么?

抗生素是倒板子的时候直接加的,直接就是有抗生素的板子,做前面几个的时候都很正常
5楼2010-04-14 12:45:03
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yinsongna

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-04-13 23:47:56:
1、我觉得你酶切以后应该跑电泳看看切的如何?
2、涂板的技术也是一个问题,我有的时候就是把菌落全都涂在平板的边上了
3、转化的时间和温度,因该控制好
4、如楼上所说,筛选药剂的量和质量要控制好

单酶切电泳看是切的很完全的,涂板问题的话,我同时还涂了2个质粒作对照,但是我涂的对照板子都长的好好的啊,应该不是涂板的问题吧
6楼2010-04-14 12:47:03
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yinsongna

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by w.king124 at 2010-04-14 12:43:32:
不是酶切回收的大片段和目的基因吗,我也是用这两个酶切的,很成功,做了两板,每板上都是长了很多,祝好运

你用的哪家的酶啊 我后来做两次单酶切的时候都要切10h以上。。。。
7楼2010-04-14 12:48:12
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gandalf886

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yinsongna at 2010-04-13 20:01:03:
最近半个多月做的转化,板子都是干干净净,具体情况是:往载体上加基因,基因和载体都是进行双酶切,酶切位点是EcorI和SalI,用的fermentas的酶,原先是双酶切再连接,一直转化不成功,后来改为两次单酶切再连接, ...

你这个两个酶切位点是不是挨着
8楼2010-04-14 12:58:16
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liyong1981

金虫 (正式写手)


肯定是载体和你片段的比例问题,你可以多几种比例来连接~转化~个人经验~试剂的问题一般不会出,
9楼2010-04-14 14:20:16
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lls850225

银虫 (小有名气)

加大片段的量试一试,我也据到过类似的~
10楼2010-04-14 16:02:17
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