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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】转化失败
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick
yinsongna(金币+1): 2010-04-14 20:09
转化的时候适当延长一下活化时间。我之前做的时候活化一个小时，转了pUC18的阳性对照长得非常好，但是我的样品转化效果就很差。后来我将活化时间延长为1.5小时，效果要好很多。再者就是连接的载体和目的片段的比例很重要，是mol比，不是体积比。根据DNA浓度仔细算一下两者的比例，转化效果会好很多的。我后来每次都仔细算，转化效果都很好的。
楼主可以试一下，祝成功噢~~
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我们都是芸芸众生的小人物，相遇相知，都是幸福！
11楼2010-04-14 17:01:30
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w.king124

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yinsongna at 2010-04-14 12:48:12:



你用的哪家的酶啊 我后来做两次单酶切的时候都要切10h以上。。。。

我用的是takara的，你那个要是单酶切能切开说明不是酶的事吧
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12楼2010-04-14 17:34:10
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yinsongna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by bettyshan at 2010-04-14 17:01:30:
转化的时候适当延长一下活化时间。我之前做的时候活化一个小时，转了pUC18的阳性对照长得非常好，但是我的样品转化效果就很差。后来我将活化时间延长为1.5小时，效果要好很多。再者就是连接的载体和目的片段的比例 ...

这个mol比怎么算？每次我都算的头昏眼花 然后就直接体积比了 以前这样做转化也转的挺好的 偏偏这次的，快一个月了。。。。。。
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13楼2010-04-14 20:10:24
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yinsongna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by w.king124 at 2010-04-14 17:34:10:

我用的是takara的，你那个要是单酶切能切开说明不是酶的事吧

takara的我也用了，能切开，但是就是转化不成功
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14楼2010-04-14 20:10:56
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yinsongna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-14 14:20:16:
肯定是载体和你片段的比例问题，你可以多几种比例来连接～转化～个人经验～试剂的问题一般不会出，

我也想过这种可能，但是还没试，我只是想比例再怎么着也有连上的吧，而且我也没有用CIAP处理，自连的情况也应该出现啊，但是每次板子都是干净的要死
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15楼2010-04-14 20:12:34
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邓远洪dyh

新虫 (小有名气)
yinsongna(金币+1):3Q 2010-04-14 20:27
可能是你载体片段处理不好，载体片段酶切后不要用胶回收，直接过回收柱。   胶回收对载体片段的线性化影响很大，特别是较大的载体。
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16楼2010-04-14 20:14:37
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
yinsongna(金币+1): 2010-04-14 20:23
载体和片段酶切回收完后可以用微量分光光度计或跑次胶看下浓度达带多少。然后我们就把载体和片段的长度当作分子量来大致计算摩尔量，然后再计算体积比。一般做两个，基本上每次都会成功。还有就是载体和片段的量不要太低了，太低了摩尔比对连接效率也不会高。
还有酶切一般双酶切就可以吧，我们一般就是切3个小时，没什么问题的。加油吧！
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17楼2010-04-14 20:18:22
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yinsongna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 邓远洪dyh at 2010-04-14 20:14:37:
可能是你载体片段处理不好，载体片段酶切后不要用胶回收，直接过回收柱。   胶回收对载体片段的线性化影响很大，特别是较大的载体。

载体7千，加个1500的片段。。。。。。。。。不算大吧
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18楼2010-04-14 20:28:50
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