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yinsongna

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】转化失败 已有10人参与

最近半个多月做的转化,板子都是干干净净,具体情况是:往载体上加基因,基因和载体都是进行双酶切,酶切位点是EcorI和SalI,用的fermentas的酶,原先是双酶切再连接,一直转化不成功,后来改为两次单酶切再连接,还是转化不成功。
原以为是没切开,但是进行但酶切的时候可以确定都切开了,连接用的solutionI 连接7h,转化之后还是不长,同时我用相同的感受态转其他质粒做对照,都能长出来,这也可以确定感受态没有问题,操作也没有问题。
转化十多遍了,现在想不出问题到底出在什么地方,跪请高手指点啊
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yuanfeng

金虫 (小有名气)

yinsongna(金币+1): 2010-04-14 20:23
载体和片段酶切回收完后可以用微量分光光度计或跑次胶看下浓度达带多少。然后我们就把载体和片段的长度当作分子量来大致计算摩尔量,然后再计算体积比。一般做两个,基本上每次都会成功。还有就是载体和片段的量不要太低了,太低了摩尔比对连接效率也不会高。
还有酶切一般双酶切就可以吧,我们一般就是切3个小时,没什么问题的。加油吧!
17楼2010-04-14 20:18:22
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)


scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-14 00:20
yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:45
是不是抗生素的问题?种类和剂量都对么?
2楼2010-04-13 22:19:41
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pidou213

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-14 00:20
yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:47
1、我觉得你酶切以后应该跑电泳看看切的如何?
2、涂板的技术也是一个问题,我有的时候就是把菌落全都涂在平板的边上了
3、转化的时间和温度,因该控制好
4、如楼上所说,筛选药剂的量和质量要控制好
见得多爱的多
3楼2010-04-13 23:47:56
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w.king124

金虫 (正式写手)


yinsongna(金币+1): 2010-04-14 12:48
不是酶切回收的大片段和目的基因吗,我也是用这两个酶切的,很成功,做了两板,每板上都是长了很多,祝好运
4楼2010-04-14 12:43:32
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