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1楼 2010-04-13 08:51:45

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summer0922

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你再说的详细点，多少度诱导的？诱导时间和IPTG浓度？

2楼2010-04-13 09:17:40

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竹林细雨

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★ ★
w.king124(金币+1): 2010-04-13 11:08
amisking(金币+2): 2010-04-13 12:57

首先测序正确么？
其次诱导条件（温度，IPTG浓度，诱导时间）
再次换个菌种，我曾经遇到过BL21不表达其他菌种就可以！

祝你好运！

3楼2010-04-13 09:46:51

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w.king124

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Originally posted by summer0922 at 2010-04-13 09:17:40:
你再说的详细点，多少度诱导的？诱导时间和IPTG浓度？

你好，我是37度，IPTG1mM诱导了五个小时

4楼2010-04-13 10:17:51

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w.king124

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Originally posted by 竹林细雨 at 2010-04-13 09:46:51:
首先测序正确么？
其次诱导条件（温度，IPTG浓度，诱导时间）
再次换个菌种，我曾经遇到过BL21不表达其他菌种就可以！

祝你好运！

谢谢你！
测序没问题，37度 IPTG1mM 诱导5个小时
你表达的什么基因，真核的吗，还是病毒的？你换什么菌株了啊

5楼2010-04-13 10:20:09

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w.king124

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自己顶一下

6楼2010-04-13 12:00:14

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月月大可

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★ ★ ★
w.king124(金币+2):谢谢你的回答！ 2010-04-13 12:50
scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-13 13:24

测序结果出来后一定要比对整个阅读框，从T7启动子区开始到终止密码子地方。
对该基因进行稀有密码子分析，看是否存在大量串联的稀有密码子出现，大量出现也会影响表达。如果是建议更换Rosetta系列菌株。
是否为膜蛋白，膜蛋白有些时候表达有一定难度。
如何鉴定不表达？取诱导前诱导后 SDS-PAGE鉴定？一些表达量低的这种方法确实看不到表达。
同时也可以做另一手准备，换载体试试看。
最后，不是所有的蛋白都可以在原核表达中表达出来的，少量蛋白不能表达，原因不详。

7楼2010-04-13 12:43:00

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w.king124

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Originally posted by 月月大可 at 2010-04-13 12:43:00:
测序结果出来后一定要比对整个阅读框，从T7启动子区开始到终止密码子地方。
对该基因进行稀有密码子分析，看是否存在大量串联的稀有密码子出现，大量出现也会影响表达。如果是建议更换Rosetta系列菌株。
是否为 ...

其实我最先做的就是在Rosetta菌株中诱导表达，SDS-PAGE电泳检测（现在也只有着一种方法可行），没有结果，之后我才在BL21中诱导的。
是不是表达的蛋白有点大呢？我的蛋白是326aa

8楼2010-04-13 13:05:42

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308145157

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★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-13 13:24
w.king124(金币+1):谢谢你的建议 2010-04-13 13:27

你可以查看下pETmanual，上面关于pET系列的问题大多都有，这个文件可以在Google上搜索下载。
重点看下N端原则，可以解释部分蛋白质检测不到表达的原因。
另外建议你做下western检测，看看是否蛋白表达量过低。
还有IPTG浓度可以做个梯度，我最高用过8mM的。

心若在，梦就在......

9楼2010-04-13 13:11:02

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大姗

铜虫 (初入文坛)

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scelab(金币+1):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-13 13:28
w.king124(金币+1):谢谢你的建议 2010-04-13 13:29

引用回帖:

Originally posted by w.king124 at 2010-04-13 10:17:51:

你好，我是37度，IPTG1mM诱导了五个小时

37度诱导是不是温度高了
低温诱导有利于蛋白质的正确折叠
可以做下20到四十摄氏度的梯度优化