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w.king124

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by 308145157 at 2010-04-13 13:11:02:
你可以查看下pETmanual,上面关于pET系列的问题大多都有,这个文件可以在Google上搜索下载。
重点看下N端原则,可以解释部分蛋白质检测不到表达的原因。
另外建议你做下western检测,看看是否蛋白表达量过低。
...

我做这个原核表达就是为了做抗体用,现在市面上没有卖这个抗体的
11楼2010-04-13 13:31:16
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whtz001

金虫 (小有名气)

换个菌种试一试
12楼2010-04-13 13:38:52
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w.king124

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by whtz001 at 2010-04-13 13:38:52:
换个菌种试一试

Rosetta和BL21都用了,再换哪个呢?请指教,谢谢
13楼2010-04-13 13:48:00
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liyong1981

金虫 (正式写手)


★ ★
w.king124(金币+1):谢谢你 2010-04-13 17:13
scelab(金币+2):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-14 00:13
1.蛋白较大,建议做WESTBLOT,PET系统的组氨酸标签很容易鉴别和纯化。SDS胶很难看得见
2.30度诱导
3.如果BL21本身没问题,那就不要换了,这个菌株是和PET经典的搭配
4.也有可能是你的阅读框变了,这也很正常,你做表达也不就是验证蛋白表达与否么
14楼2010-04-13 14:39:02
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panda73

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
scelab(金币+3):鼓励新虫!欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-14 00:14
你确定菌株是BL21(DE3)吗? 如果是BL21,pET系列质粒是不能表达的。
15楼2010-04-13 17:01:15
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muchong5577

金虫 (正式写手)

请问你是怎么检测蛋白的?确认是包涵体还是可溶性表达了吗?
16楼2010-04-13 17:12:45
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w.king124

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-13 14:39:02:
1.蛋白较大,建议做WESTBLOT,PET系统的组氨酸标签很容易鉴别和纯化。SDS胶很难看得见
2.30度诱导
3.如果BL21本身没问题,那就不要换了,这个菌株是和PET经典的搭配
4.也有可能是你的阅读框变了,这也很正常, ...

现在关键是没有这个蛋白的一抗啊,买也买不到的
17楼2010-04-13 17:15:05
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w.king124

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by muchong5577 at 2010-04-13 17:12:45:
请问你是怎么检测蛋白的?确认是包涵体还是可溶性表达了吗?

就是简单地做了一下SDS-PAGE,破碎后,取上清和沉淀跑电泳
18楼2010-04-13 17:17:50
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w.king124

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by panda73 at 2010-04-13 17:01:15:
你确定菌株是BL21(DE3)吗? 如果是BL21,pET系列质粒是不能表达的。

这个应该是肯定的
19楼2010-04-13 17:19:07
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w.king124

金虫 (正式写手)

20楼2010-04-13 20:27:20
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