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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】做过原核表达的高手请进！！！
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w.king124

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 308145157 at 2010-04-13 13:11:02:
你可以查看下pETmanual，上面关于pET系列的问题大多都有，这个文件可以在Google上搜索下载。
重点看下N端原则，可以解释部分蛋白质检测不到表达的原因。
另外建议你做下western检测，看看是否蛋白表达量过低。
...

我做这个原核表达就是为了做抗体用，现在市面上没有卖这个抗体的
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11楼2010-04-13 13:31:16
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whtz001

金虫 (小有名气)
换个菌种试一试
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12楼2010-04-13 13:38:52
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w.king124

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by whtz001 at 2010-04-13 13:38:52:
换个菌种试一试

Rosetta和BL21都用了，再换哪个呢？请指教，谢谢
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13楼2010-04-13 13:48:00
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★ ★
w.king124(金币+1):谢谢你 2010-04-13 17:13
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-14 00:13
1.蛋白较大，建议做WESTBLOT，PET系统的组氨酸标签很容易鉴别和纯化。SDS胶很难看得见
2.30度诱导
3.如果BL21本身没问题，那就不要换了，这个菌株是和PET经典的搭配
4.也有可能是你的阅读框变了，这也很正常，你做表达也不就是验证蛋白表达与否么
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14楼2010-04-13 14:39:02
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panda73

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
scelab(金币+3):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-14 00:14
你确定菌株是BL21(DE3)吗？ 如果是BL21,pET系列质粒是不能表达的。
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15楼2010-04-13 17:01:15
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muchong5577

金虫 (正式写手)
请问你是怎么检测蛋白的？确认是包涵体还是可溶性表达了吗？
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16楼2010-04-13 17:12:45
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w.king124

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-13 14:39:02:
1.蛋白较大，建议做WESTBLOT，PET系统的组氨酸标签很容易鉴别和纯化。SDS胶很难看得见
2.30度诱导
3.如果BL21本身没问题，那就不要换了，这个菌株是和PET经典的搭配
4.也有可能是你的阅读框变了，这也很正常， ...

现在关键是没有这个蛋白的一抗啊，买也买不到的
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17楼2010-04-13 17:15:05
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w.king124

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by muchong5577 at 2010-04-13 17:12:45:
请问你是怎么检测蛋白的？确认是包涵体还是可溶性表达了吗？

就是简单地做了一下SDS-PAGE，破碎后，取上清和沉淀跑电泳
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18楼2010-04-13 17:17:50
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w.king124

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by panda73 at 2010-04-13 17:01:15:
你确定菌株是BL21(DE3)吗？ 如果是BL21,pET系列质粒是不能表达的。

这个应该是肯定的
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19楼2010-04-13 17:19:07
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w.king124

金虫 (正式写手)
20楼2010-04-13 20:27:20
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