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月月大可

木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-14 00:14
w.king124(金币+2):非常感谢你的回答,方便的话,可以加你qq聊一下吗,我的号码是154722175 2010-04-14 12:21
三百多个氨基酸不算大,我现在表达的有三百五十个。早期还做过个五百多个氨基酸的。

阅读框问题非常重要,见过有人把原质粒起始区去掉去做表达的,这种对质粒本身结构改变的测序显示正确,但肯定不会表达。

其次做为鉴定表达与否的方法就是在37度加1mM的IPTG诱导个4-5个小时,取诱导前和诱导后的全菌,加入Loading Buffer,煮10分钟后高速离心片刻即可上样。如果诱导后相对于诱导前在预期大小处出现条带,表达!没有多出条带则认为没有表达。

再者你是否能确定载体没有问题?! 是否用该载体表达过其他蛋白,确定载体没有问题? 最早做表达的时候折腾了一个月不见蛋白表达,对载体测序显示启动子区和终止子区都正确,但是就是不表达。后来把我目的片段直接切下来替换了师姐表达载体中的片段,诱导,成功表达!  载体用的都是pET28a,但是我的就是不会表达,师姐的就可以。     后来闲着没事的时候又把师姐的片段切下来放在我的载体中,呵呵,不表达!!!!

[ Last edited by 月月大可 on 2010-4-13 at 22:33 ]
21楼2010-04-13 22:32:21
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