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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请大家帮我分析下原因 关于原核表达
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pwj

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请大家帮我分析下原因 关于原核表达 已有6人参与

大家好！请高手帮忙分析下
我构建了一个PET30a表达载体，经过酶切、PCR都已经验证了。而且基因编码也没问题，但最近最诱导时，OD600为0.6后，加入IPTG就不怎么长了，而且无目的蛋白的表达，这是为什么啊？

我都诱导4小时后加SDS上样缓冲液，煮5分钟，然后上样

[ Last edited by pwj on 2010-4-9 at 21:11 ]
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1楼 2010-04-09 21:05:01
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DNAhelix

银虫 (著名写手)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-10 12:04
蛋白不表达问题真不好说。
1、用其他重组表达质粒测试下表达菌及操作有没有问题。
2、切换其它可表达蛋白测试下你的质粒或目的蛋白有没有问题。
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智慧活法：不生气，不计较！
2楼2010-04-09 22:45:30
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mwgyanchu

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-10 12:05
首先你用的表达菌株是什么？加入的IPTG的量与诱导的条件都是影响蛋白表达的关键因素。
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3楼2010-04-09 23:19:53
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pwj

银虫 (小有名气)
我用的BL21（DE3）  IPTG浓度分别是0.1、0.4、0.8、1.0  诱导4小时就是不表达
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4楼2010-04-10 18:51:52
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lingshao405

金虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-11 10:36
可以试试BL21(DE3)pLyss
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加油，加加油！
5楼2010-04-10 20:23:08
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mwgyanchu

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-11 10:36
楼主，要不你可以考虑换成Rosetta菌株，另外诱导的温度也要考虑。
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6楼2010-04-10 21:02:28
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pwj

银虫 (小有名气)
请问有人有Rosetta系列菌株吗？我刚看了我的基因1459个氨基酸
有17个稀有密码子  影响大吗？
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7楼2010-04-10 22:09:21
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acaifeng

银虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
表达量较少时蛋白胶上看不见明显的条带，可以做western blot检测一下。
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8楼2010-04-12 09:12:38
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pwj

银虫 (小有名气)
恩！谢谢各位了！
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9楼2010-04-12 11:23:50
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dy_414

木虫 (正式写手)
★
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1.IPTG的浓度是否适合
2.煮5min貌似有点短，我都是煮半小时的
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我坚信，rp是攒出来的
10楼2010-04-12 11:30:37
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