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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】taq酶 加A

我用PFU酶做PCR,最后想加A,用的是dNTP,能保证最后加的是A吗?不是很明白啊,有哪位高手指点一下~~谢谢
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

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1949stone(金币+1): 2010-03-31 08:35
taq酶 的特性就是加A,不加别的.
2楼2010-03-30 21:17:32
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

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1949stone(金币+1): 2010-03-31 08:35
肯定不行。
好像是在反应里添加一些Taq酶就可以了
3楼2010-03-30 21:18:37
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader

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1949stone(金币+1): 2010-03-31 08:36
the protocol is following:
1. Use 1–2μl of the DNA fragment.
2. Add 1μl of Taq DNA Polymerase Reaction 10X Buffer.
3. Add 1μl of 25mM MgCl2
4. Add dATP to a final concentration of 0.2mM.
5. Add 5 units of Taq DNA Polymerase.
6. Add Nuclease-Free Water to a final volume of 10μl.
7. Incubate at 70°C for 30 minutes.
会当凌绝顶,一览众山小
4楼2010-03-30 21:48:52
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)

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1949stone(金币+1): 2010-03-31 08:36
想做TA克隆,就要在pfu扩增后回收PCR产物,之后加Taq polymerase 以及其他的PCR反应成分,或者以dATP替代dNTP,37度温浴半小时就可以了。。。
5楼2010-03-30 23:41:10
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gyesang

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引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2010-03-30 21:17:32:
taq酶 的特性就是加A,不加别的.

你说的不准确,taq DNA polymerase加尾时是优先加A,但没有A存在,他会加其他的碱基,这就是我们有时候用Taq酶可以制备T载体,就是加T尾
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2010-03-30 23:46:35
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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引用回帖:
Originally posted by huangdi07 at 2010-03-30 18:25:33:
我用PFU酶做PCR,最后想加A,用的是dNTP,能保证最后加的是A吗?不是很明白啊,有哪位高手指点一下~~谢谢

可以的,最好是将产物纯化一下,然后用dNTP或者dATP,都可以的,用taq酶半小时,不提倡在反应体系中直接加taq,因为pfu还是会将加A尾切掉
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2010-03-30 23:48:43
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)


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我们一般是在添加Taq,dATP后在72度30min,只要不是片段太长,做TA克隆的效率很高。
8楼2010-03-31 20:27:10
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yangjunzju

木虫 (正式写手)


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TAQ酶扩增不就好了嘛。。。末端加A
9楼2010-03-31 21:45:13
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spiderboy

金虫 (正式写手)


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楼主,加A实验我做过很多次了。用TAQ酶,选用正常的PCR反应体系就可以了,用dNTP就可以了,毕竟实验室不一定有dATP,,72度半小时以上,然后做过柱纯化片段即可,不用跑电泳。最后挑选到得阳性克隆比例还是挺高的。。
10楼2010-03-31 22:57:03
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