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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】taq酶 加A
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】taq酶 加A

我用PFU酶做PCR，最后想加A，用的是dNTP,能保证最后加的是A吗？不是很明白啊，有哪位高手指点一下～～谢谢
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1楼 2010-03-30 18:25:33
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
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1949stone(金币+1): 2010-03-31 08:35
taq酶 的特性就是加A,不加别的.
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2楼2010-03-30 21:17:32
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
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1949stone(金币+1): 2010-03-31 08:35
肯定不行。
好像是在反应里添加一些Taq酶就可以了
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3楼2010-03-30 21:18:37
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
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1949stone(金币+1): 2010-03-31 08:36
the protocol is following:
1. Use 1–2μl of the DNA fragment.
2. Add 1μl of Taq DNA Polymerase Reaction 10X Buffer.
3. Add 1μl of 25mM MgCl2
4. Add dATP to a final concentration of 0.2mM.
5. Add 5 units of Taq DNA Polymerase.
6. Add Nuclease-Free Water to a final volume of 10μl.
7. Incubate at 70°C for 30 minutes.
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会当凌绝顶，一览众山小
4楼2010-03-30 21:48:52
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)
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1949stone(金币+1): 2010-03-31 08:36
想做TA克隆，就要在pfu扩增后回收PCR产物，之后加Taq polymerase 以及其他的PCR反应成分，或者以dATP替代dNTP，37度温浴半小时就可以了。。。
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5楼2010-03-30 23:41:10
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
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引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2010-03-30 21:17:32:
taq酶 的特性就是加A,不加别的.

你说的不准确，taq DNA polymerase加尾时是优先加A，但没有A存在，他会加其他的碱基，这就是我们有时候用Taq酶可以制备T载体，就是加T尾
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6楼2010-03-30 23:46:35
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
Originally posted by huangdi07 at 2010-03-30 18:25:33:
我用PFU酶做PCR，最后想加A，用的是dNTP,能保证最后加的是A吗？不是很明白啊，有哪位高手指点一下～～谢谢

可以的，最好是将产物纯化一下，然后用dNTP或者dATP，都可以的，用taq酶半小时，不提倡在反应体系中直接加taq，因为pfu还是会将加A尾切掉
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7楼2010-03-30 23:48:43
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
★
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我们一般是在添加Taq，dATP后在72度30min，只要不是片段太长，做TA克隆的效率很高。
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8楼2010-03-31 20:27:10
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yangjunzju

木虫 (正式写手)
★
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TAQ酶扩增不就好了嘛。。。末端加A
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9楼2010-03-31 21:45:13
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★
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楼主，加A实验我做过很多次了。用TAQ酶，选用正常的PCR反应体系就可以了，用dNTP就可以了，毕竟实验室不一定有dATP,，72度半小时以上，然后做过柱纯化片段即可，不用跑电泳。最后挑选到得阳性克隆比例还是挺高的。。
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10楼2010-03-31 22:57:03
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