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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白可溶性表达问题。
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 nicknelson 的 1 个金币

nicknelson

至尊木虫 (职业作家)

[交流] 【求助/交流】蛋白可溶性表达问题。

我在试管中0.1mM IPTG, 室温（19℃），150rpm，诱导8h，大概30%在上清表达。

同样的条件，我在500mL锥形瓶摇100mL菌液，结果全在包涵体。

于是我把条件改成0.02/0.05/0.1 mM IPTG三个浓度，室温（19℃），60rpm，诱导8h，结果还是全在沉淀里表达！

请高人指导啊！！！！！
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1楼 2010-02-27 20:21:01
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2): 2010-02-28 22:27
nicknelson(金币+2):thanks 2010-03-07 17:02
在加入IPTG诱导前把菌液放在冰水混合物中让其充分冷却之后再加入IPTG去诱导。
有书上写降低诱导时的OD值有利于可溶表达，我没有尝试过。
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2楼2010-02-28 09:41:37
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
不过我看书上写培养体积越低，确实能增加可溶性表达比例。谢谢！
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-02-28 09:41:37:
在加入IPTG诱导前把菌液放在冰水混合物中让其充分冷却之后再加入IPTG去诱导。
有书上写降低诱导时的OD值有利于可溶表达，我没有尝试过。

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3楼2010-02-28 12:10:59
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Charlie1331

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3): 2010-02-28 22:27
nicknelson(金币+2):说的没错，可是有什么建议没？ 2010-03-07 17:02
怀疑在试管里培养时，由于体积小，溶氧差，菌体生长情况应该不好，此时诱导，不会大量表达产生目的蛋白；而在摇瓶中培养，溶氧等各方面都比试管强，菌体生长良好，具有较强的合成能力，而IPTG又是强诱导剂，估计用的也是T7启动子，强上加强，所以产生了包涵体。
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4楼2010-02-28 22:09:10
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guoenwen

金虫 (小有名气)
同意三角瓶培养的时候溶氧不足的说法，我遇到过相似的问题。
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5楼2010-03-01 08:17:36
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
nicknelson(金币+2):thanks 2010-03-07 17:03
可溶性表达与否起决定作用的是序列本身，所以有时候你是无论如何也得不得的

但优化条件还是可以得到部分可溶性的

你的条件优化做的还不够，

另外60rpm不好
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6楼2010-03-01 17:52:51
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
我这次又又优化了一次：
IPTG 0.02mM，0.1mM
转速：60，120rpm
体积：5mL，10mL
总共8组，可是这回没有一次上清有表达的。疯了。
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-03-01 17:52:51:
可溶性表达与否起决定作用的是序列本身，所以有时候你是无论如何也得不得的

但优化条件还是可以得到部分可溶性的

你的条件优化做的还不够，

另外60rpm不好

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7楼2010-03-01 18:30:38
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dy_414

木虫 (正式写手)
nicknelson(金币+1):thanks 2010-03-07 17:03
降低IPTG浓度，还有就是低温诱导长时间

另外换一个载体看看吧
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我坚信，rp是攒出来的
8楼2010-03-02 12:24:14
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Charlie1331

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by Charlie1331 at 2010-02-28 22:09:10:
怀疑在试管里培养时，由于体积小，溶氧差，菌体生长情况应该不好，此时诱导，不会大量表达产生目的蛋白；而在摇瓶中培养，溶氧等各方面都比试管强，菌体生长良好，具有较强的合成能力，而IPTG又是强诱导剂，估计用 ...

首先呢，根据经验，可以试一下不诱导的情况。由于T7有着较强的本底表达，所以，不诱导，也会有蛋白合成；如果不成，那么就可以查阅一些关于增加膜透性的文章。包涵体形成的原因就有膜向外转运蛋白的能力与其合成能力不相匹配，可适量添加一些表面活性剂处理。
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9楼2010-03-07 22:18:52
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者
引用回帖:
Originally posted by Charlie1331 at 2010-02-28 22:09:10:
怀疑在试管里培养时，由于体积小，溶氧差，菌体生长情况应该不好，此时诱导，不会大量表达产生目的蛋白；而在摇瓶中培养，溶氧等各方面都比试管强，菌体生长良好，具有较强的合成能力，而IPTG又是强诱导剂，估计用 ...

很好，发酵工程您入门啦！
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
10楼2010-03-08 09:09:33
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