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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR扩增问题：非特异条带！
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yxx41

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR扩增问题：非特异条带！ 已有6人参与

用报道的引物进行PCR，但是出现了很多非特异性条带：
泳道          模板              退火温度
1             cDNA              60
2             cDNA              58
3             cDNA              54
4             菌1总DNA       60
5             同上                 58
6            marker DL 2000
7             菌1总DNA       54
8             菌2总DNA       60
9                   同上           58
10                 同上           54

原因是何？如何解决？
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1楼 2009-12-31 16:52:54
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qingfengwu

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+3,VIP+0):谢谢交流 12-31 17:10
yxx41(金币+3,VIP+0): 1-1 10:02
1 使用特异性高的PCR溶液进行，比如hot-start溶液，而不是用普通的taq
   这样比较容易扩增到特异性高的。takara公司有很多特异性很好的hot-start 酶。
2 把PCR protocol换成touch down等方式，不用一般的程序。
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2楼2009-12-31 17:07:57
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85715623

木虫 (正式写手)
★
yxx41(金币+1,VIP+0): 1-1 10:02
应该考虑一下DNA提的怎么样啊？
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3楼2009-12-31 17:57:27
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caoliang38

铁虫 (小有名气)
★
yxx41(金币+1,VIP+0): 1-1 10:02
我们只能说出所有问题的中的几个，你降低下引物的浓度吧 另外楼主你的目的条带是哪个？
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4楼2009-12-31 18:03:38
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新人小玥

木虫 (正式写手)
★
yxx41(金币+1,VIP+0): 1-1 10:02
换换酶试试
我也出现过这种问题
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5楼2009-12-31 18:49:10
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yzhang1986

铁杆木虫 (文坛精英)

优秀版主
★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-31 21:13
yxx41(金币+1,VIP+0): 1-1 10:02
查查引物的特异性
酶对特异性有很大影响么，学习了
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6楼2009-12-31 21:01:45
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
yxx41(金币+3,VIP+0): 1-1 10:02
1、建议退火温度范围在向上设置几度试试。看你的图好像也是温度越低，特异性越差啊。
2、个人认为虽然国外的文献可信度比较高，但也不能全信，国内国外造假的都大量存在。所以可能是报道的引物不可信。建议自己设计，文献只是参考。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
7楼2009-12-31 21:27:18
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2009-12-31 21:27:
1、建议退火温度范围在向上设置几度试试。看你的图好像也是温度越低，特异性越差啊。
2、个人认为虽然国外的文献可信度比较高，但也不能全信，国内国外造假的都大量存在。所以可能是报道的引物不可信。建议自己设 ...

觉得退火温度升几度说得比较有道理，根据我的经验，三度左右没有问题
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8楼2010-01-03 09:58:45
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loveinbattle

银虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用touch down看看
或者就是cDNA不太好~~不行就重新提一下看看
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9楼2010-01-06 14:55:15
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Liling1990

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
做过两条，还没见过这么多
赞一下(1人) 回复此楼
上升中。。。
10楼2010-01-06 17:27:26
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