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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】增加引物量有作用吗？
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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】增加引物量有作用吗？

PCR 结果一直不好。后来增加了模板量，有些样品扩增出来了，但有些还是没条带。现在感觉就剩增加引物这一个能改善的条件了。不知这个会不会有作用？因为模板不多了，所以不敢轻易尝试啊。在此向有经验的同学请教一下。
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1楼 2009-12-18 05:17:21
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jlzkchong

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+4,VIP+0):谢谢 12-18 12:47
gdongli8325(金币+1,VIP+0): 12-18 15:44
引用回帖:
Originally posted by gdongli8325 at 2009-12-18 05:17:
PCR 结果一直不好。后来增加了模板量，有些样品扩增出来了，但有些还是没条带。现在感觉就剩增加引物这一个能改善的条件了。不知这个会不会有作用？因为模板不多了，所以不敢轻易尝试啊。在此向有经验的同学请教一 ...

不知道你的模板是什么？如果是质粒DNA的话，可以转化大肠杆菌，长出单菌落后挑斑摇菌，提质粒。增加引物量是没什么用的，扩增不到目的片段，估计只能是模板中所含你的目的片段量很少，你可以回收已经扩增出来的目的条带，用回收产物再做PCR
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2楼2009-12-18 09:44:19
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yiyiglad

★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0):是个好办法 12-18 12:48
gdongli8325(金币+1,VIP+0): 12-18 15:44
循环数加大，然后将扩增产物回收，进行二次扩增
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3楼2009-12-18 10:05:17
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0):同意 12-18 12:48
gdongli8325(金币+1,VIP+0): 12-18 15:44
引物增加基本没什么用的。，引物的设计很重要
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4楼2009-12-18 10:55:54
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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)
关键是没有条带啊，一点都没有
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5楼2009-12-18 15:46:47
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apple-z

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
PCR体系中每样东西的浓度都是有一定要求的，不能随便的增大或减少。
引物在反应体系中的终浓度一般为0.1~0.5uM
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6楼2009-12-18 16:53:32
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我提供一种方法给你


如下

米可以做巢式PCR，或者半巢式PCR，具体的话，这个技术很成熟了，你查阅下，据你所说的，我估计是本身含量就很低。

另：我仍然认为引物设计的问题是首要需要分析的，其次是你的模板的浓度，如果两者都没问题，可以考虑下我上面的建议。

祝你实验顺利
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7楼2009-12-18 16:55:36
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yanlili

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
退火，延伸的温度没问题吗？考虑一下
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8楼2009-12-18 18:05:18
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meigaofu

禁虫 (小有名气)
★
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本帖内容被屏蔽
9楼2009-12-18 18:22:12
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hyde0706

木虫 (正式写手)
引物的量影响不是很大，如果你只是普通PCR的话。提高效率首先要考察模板的质量，其次是扩增的体系，还有就是PCR程序了。
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10楼2009-12-18 21:38:19
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