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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】增加引物量有作用吗?

PCR 结果一直不好。后来增加了模板量,有些样品扩增出来了,但有些还是没条带。现在感觉就剩增加引物这一个能改善的条件了。不知这个会不会有作用?因为模板不多了,所以不敢轻易尝试啊。在此向有经验的同学请教一下。
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jlzkchong

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+4,VIP+0):谢谢 12-18 12:47
gdongli8325(金币+1,VIP+0): 12-18 15:44
引用回帖:
Originally posted by gdongli8325 at 2009-12-18 05:17:
PCR 结果一直不好。后来增加了模板量,有些样品扩增出来了,但有些还是没条带。现在感觉就剩增加引物这一个能改善的条件了。不知这个会不会有作用?因为模板不多了,所以不敢轻易尝试啊。在此向有经验的同学请教一 ...

不知道你的模板是什么?如果是质粒DNA的话,可以转化大肠杆菌,长出单菌落后挑斑摇菌,提质粒。增加引物量是没什么用的,扩增不到目的片段,估计只能是模板中所含你的目的片段量很少,你可以回收已经扩增出来的目的条带,用回收产物再做PCR
2楼2009-12-18 09:44:19
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yiyiglad

★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0):是个好办法 12-18 12:48
gdongli8325(金币+1,VIP+0): 12-18 15:44
循环数加大,然后将扩增产物回收,进行二次扩增
3楼2009-12-18 10:05:17
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liyong1981

金虫 (正式写手)


★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0):同意 12-18 12:48
gdongli8325(金币+1,VIP+0): 12-18 15:44
引物增加基本没什么用的。,引物的设计很重要
4楼2009-12-18 10:55:54
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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

关键是没有条带啊,一点都没有
5楼2009-12-18 15:46:47
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apple-z

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
PCR体系中每样东西的浓度都是有一定要求的,不能随便的增大或减少。
引物在反应体系中的终浓度一般为0.1~0.5uM
6楼2009-12-18 16:53:32
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liyong1981

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我提供一种方法给你


如下

米可以做巢式PCR,或者半巢式PCR,具体的话,这个技术很成熟了,你查阅下,据你所说的,我估计是本身含量就很低。

另:我仍然认为引物设计的问题是首要需要分析的,其次是你的模板的浓度,如果两者都没问题,可以考虑下我上面的建议。

祝你实验顺利
7楼2009-12-18 16:55:36
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yanlili

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
退火,延伸的温度没问题吗?考虑一下
8楼2009-12-18 18:05:18
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meigaofu

禁虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
本帖内容被屏蔽

9楼2009-12-18 18:22:12
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hyde0706

木虫 (正式写手)

引物的量影响不是很大,如果你只是普通PCR的话。提高效率首先要考察模板的质量,其次是扩增的体系,还有就是PCR程序了。
10楼2009-12-18 21:38:19
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