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【不合理蛙科研实验分享趣事】冷冻扫描电镜观乳酸菌冰晶瞬间
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| 我改液体EM-grid法：5 µL菌液（A600≈0.8）滴于铜台，背面吸干，立即液氮泥-210 ℃冻结，全程<8 s。预冷传输杆-190 ℃进舱，抽真空至2×10⁻⁴ Pa，-95 ℃升华蚀刻90 s，去表面冰层，再-130 ℃喷铂5 mA 60 s，厚约5 nm。经验：升华温度±2 ℃即决定蚀刻深度，过低膜结构被冰遮，过高细胞塌陷；铂靶距30 mm，角度45°，可覆均匀；观察用3 kV，工作距离6 mm，spot 2.5，二次电子像最锐。若见冰晶条纹，立即升舱温至-90 ℃再升华30 s，可消伪影。我拍到的分裂中乳酸菌，隔膜厚25 nm，冰晶孔洞<50 nm，连续拍30视野无重结冰，照片直接用于三维重构。 |
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