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幸运蓝霉

新虫 (初入文坛)

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[交流] 重组pPIC9K质粒构建及GS115酵母表达

本人目前刚开始做毕赤酵母表达，实验室没有相关背景，很多地方不明白，希望各路大神指点
1、我已经构建好重组质粒，但是现在有点不确定构建是否有问题：我的目的基因插入在5‘aox1及a- factor后面，但是我把原本a- factor后面，taa之前，的30bp删去了，不知有没有影响 2、在线性化酶切时，酶切效率很低，50ul体系，其中dna 4ul（约4ug），酶1ul，37度酶切1h，用的是takara的快切酶，怎样能提高酶切效率呢，是需要加大酶量还是延长酶切时间？
3、电转之后转化子特别少，电转参数3kv，6ms，请问怎么才能提高转化率？
4、实验室摇床只能达到200rpm，手册上推荐220-250rpm，请问转速低会不会影响表达？ 5、摇瓶发酵阶段需不需要控制ph？我是初始ph为5.0，用的是bmmy培养基
6、我用的载体ppic9k按理说是分泌表达，但是我分析发酵上清，发现目的蛋白表达量特别低，之前用的是单拷贝菌株，会不会是因为这个呢？还是说有可能没有分泌出来，需要破胞分析一下？
本人菜鸟阶段问题有点多，感谢各位赐教！！

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1楼 2024-09-05 21:02:47

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sadpotato

铁虫 (初入文坛)

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有一些提高电转效率的小建议，首先整个过程中用到的洗涤的山梨醇溶液和水溶液都是超纯水，三角瓶，离心管和电击杯最好也都用超纯水润洗；其次线性化载体浓度一定要高，需要测一下DNA浓度，加入量在5μg左右，胶回收最后洗脱液用ddH2O；我的电击条件是1500 V，5 ms，电击后立刻加入1 ml预冷的1 mol/L山梨醇，混匀后转入2 ml无菌的EP管中，28℃培养箱静置1 h后加入1 ml无药YPD培养基温育2 h。

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10楼2025-01-13 14:36:22

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strongFv

新虫 (初入文坛)

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虫号: 24591529

★
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问题2：你看下takara建议的酶切时间是多久，可以稍微延长点，快酶的话切个三四个小时都不过分。我记得擎科有那种同源重组送线性化裁体的，如果载体线性化老出问题，用这个现成的就省事得多。就是不知道有没有你这个载体，可以去看看

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7楼2024-09-06 10:01:58

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幸运蓝霉

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

7楼: Originally posted by strongFv at 2024-09-06 10:01:58
问题2：你看下takara建议的酶切时间是多久，可以稍微延长点，快酶的话切个三四个小时都不过分。我记得擎科有那种同源重组送线性化裁体的，如果载体线性化老出问题，用这个现成的就省事得多。就是不知道有没有你这个 ...

好的感谢回复！说明书写不能超过4h酶切易产生星活性，那下次试一下延长到2h