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幸运蓝霉

新虫 (初入文坛)


[交流] 重组pPIC9K质粒构建及GS115酵母表达

本人目前刚开始做毕赤酵母表达,实验室没有相关背景,很多地方不明白,希望各路大神指点
1、我已经构建好重组质粒,但是现在有点不确定构建是否有问题:我的目的基因插入在5‘aox1及a- factor后面,但是我把原本a- factor后面,taa之前,的30bp删去了,不知有没有影响 2、在线性化酶切时,酶切效率很低,50ul体系,其中dna 4ul(约4ug),酶1ul,37度酶切1h,用的是takara的快切酶,怎样能提高酶切效率呢,是需要加大酶量还是延长酶切时间?
3、电转之后转化子特别少,电转参数3kv,6ms,请问怎么才能提高转化率?
4、实验室摇床只能达到200rpm,手册上推荐220-250rpm,请问转速低会不会影响表达? 5、摇瓶发酵阶段需不需要控制ph?我是初始ph为5.0,用的是bmmy培养基
6、我用的载体ppic9k按理说是分泌表达,但是我分析发酵上清,发现目的蛋白表达量特别低,之前用的是单拷贝菌株,会不会是因为这个呢?还是说有可能没有分泌出来,需要破胞分析一下?
本人菜鸟阶段问题有点多,感谢各位赐教!!

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strongFv

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
问题2:你看下takara建议的酶切时间是多久,可以稍微延长点,快酶的话切个三四个小时都不过分。我记得擎科有那种同源重组送线性化裁体的,如果载体线性化老出问题,用这个现成的就省事得多。就是不知道有没有你这个载体,可以去看看
7楼2024-09-06 10:01:58
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幸运蓝霉

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
7楼: Originally posted by strongFv at 2024-09-06 10:01:58
问题2:你看下takara建议的酶切时间是多久,可以稍微延长点,快酶的话切个三四个小时都不过分。我记得擎科有那种同源重组送线性化裁体的,如果载体线性化老出问题,用这个现成的就省事得多。就是不知道有没有你这个 ...

好的感谢回复!说明书写不能超过4h酶切易产生星活性,那下次试一下延长到2h

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8楼2024-09-07 10:21:02
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sadpotato

铁虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
有一些提高电转效率的小建议,首先整个过程中用到的洗涤的山梨醇溶液和水溶液都是超纯水,三角瓶,离心管和电击杯最好也都用超纯水润洗;其次线性化载体浓度一定要高,需要测一下DNA浓度,加入量在5μg左右,胶回收最后洗脱液用ddH2O;我的电击条件是1500 V,5 ms,电击后立刻加入1 ml预冷的1 mol/L山梨醇,混匀后转入2 ml无菌的EP管中,28℃培养箱静置1 h后加入1 ml无药YPD培养基温育2 h。
10楼2025-01-13 14:36:22
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hyjcs3楼
2024-09-05 21:28   回复  
幸运蓝霉(金币+2): 谢谢参与
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2024-09-05 21:30   回复  
幸运蓝霉(金币+2): 谢谢参与
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XG-WUST5楼
2024-09-05 22:12   回复  
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