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[交流]
重组pPIC9K质粒构建及GS115酵母表达
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本人目前刚开始做毕赤酵母表达，实验室没有相关背景，很多地方不明白，希望各路大神指点 1、我已经构建好重组质粒，但是现在有点不确定构建是否有问题：我的目的基因插入在5‘aox1及a- factor后面，但是我把原本a- factor后面，taa之前，的30bp删去了，不知有没有影响 2、在线性化酶切时，酶切效率很低，50ul体系，其中dna 4ul（约4ug），酶1ul，37度酶切1h，用的是takara的快切酶，怎样能提高酶切效率呢，是需要加大酶量还是延长酶切时间？ 3、电转之后转化子特别少，电转参数3kv，6ms，请问怎么才能提高转化率？ 4、实验室摇床只能达到200rpm，手册上推荐220-250rpm，请问转速低会不会影响表达？ 5、摇瓶发酵阶段需不需要控制ph？我是初始ph为5.0，用的是bmmy培养基 6、我用的载体ppic9k按理说是分泌表达，但是我分析发酵上清，发现目的蛋白表达量特别低，之前用的是单拷贝菌株，会不会是因为这个呢？还是说有可能没有分泌出来，需要破胞分析一下？ 本人菜鸟阶段问题有点多，感谢各位赐教！！ 发自小木虫IOS客户端 |
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