| 查看: 1186 | 回复: 13 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
[交流]
求助大片段载体构建
|
|||
|
我最近在将一个4700bp的基因连进T载体中，可是一直没有成功，现在已经做了3次了。大家有没有什么好的方法可以改进连接效率？ 我的步骤如下： 基因4700bp，用primer star扩增之后，切胶回收目的条带，回收效率还行（取回收产物1ul做模板pcr能扩增出目的条带来），之后加A（8ul底物，30min），连进T载体（promega的），一般4度连接过夜，转化，蓝白斑筛选。第二天板子上能看见白斑，但是挑斑，pcr验证却总是假阳性，提质粒验证，分子量是2500bp左右，肯定是T载体自连了。但是那些白斑是什么啊？ 现在做了3次都是这样，就是连不进去。快郁闷死了，大家有什么好的建议？多谢了!!! |
回复此楼» 猜你喜欢
一志愿沪9，326求生物学调剂
已经有7人回复
-
化工学硕294分，求导师收留
已经有24人回复
-
085600材料与化工329分求调剂
已经有10人回复
-
284求调剂
已经有10人回复
-
复试调剂
已经有18人回复
-
310求调剂
已经有16人回复
-
274求调剂
已经有7人回复
-
245求调剂
已经有7人回复
-
有爆料，一个青年教师卖房得400万，然后换了一个四青帽子
已经有11人回复
-
290求调剂
已经有15人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
scelab
荣誉版主 (文坛精英)
小木虫之有关部门负责人
- 应助: 63 (初中生)
- 贵宾: 1.475
- 金币: 8294.6
- 散金: 4158
- 红花: 39
- 沙发: 99
- 帖子: 21277
- 在线: 3169.3小时
- 虫号: 482065
- 注册: 2007-12-20
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
- 管辖: 微生物
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
plantst5928(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+6,VIP+0): 10-8 15:50
plantst5928(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+6,VIP+0): 10-8 15:50
|
4.7k的不算大，连应该没问题的。 你的a尾加的有问题吗，一般的酶都可以吧，都是pcr的时候加上的。 酶连4-16°都可以的，这个没问题。8h以上都可以。 关于白斑的这个，大家都遇到过，理论上自联应该是蓝斑，但是好多时候是白的。个人认为其可能连上了一些很小的片段，<100bp。你可以随机拿几个去测序看看，验证自己的想法。看看到底是空的还是连上了什么东西。 至于重复的，你做的时候可以多做几个，t量不变，片段有差别，做几个，总有一个可以的。 祝实验成功！ |
2楼2009-10-08 15:32:11
amisking
荣誉版主 (文坛精英)
- 应助: 45 (小学生)
- 贵宾: 28.304
- 金币: 51353.9
- 散金: 3080
- 红花: 78
- 沙发: 17
- 帖子: 13022
- 在线: 839小时
- 虫号: 514230
- 注册: 2008-02-28
- 性别: GG
- 专业: 微生物资源与分类学
- 管辖: 分子生物
3楼2009-10-08 15:50:43
qgaoamtf
至尊木虫 (职业作家)
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 13397.4
- 散金: 1937
- 红花: 5
- 帖子: 4119
- 在线: 903.4小时
- 虫号: 447303
- 注册: 2007-10-31
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传育种学
4楼2009-10-08 16:01:24
5楼2009-10-08 16:57:56
rainbamboo8707
金虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 746.2
- 帖子: 255
- 在线: 6.4小时
- 虫号: 668606
- 注册: 2008-12-05
- 专业: 水产生物遗传育种学
6楼2009-10-08 18:33:40
09021122
木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2064.5
- 红花: 1
- 沙发: 1
- 帖子: 518
- 在线: 113.5小时
- 虫号: 856621
- 注册: 2009-09-25
- 性别: GG
- 专业: 系统生物学
7楼2009-10-08 20:41:42
8楼2009-10-08 21:17:08
9楼2009-10-08 23:03:22
scelab
荣誉版主 (文坛精英)
小木虫之有关部门负责人
- 应助: 63 (初中生)
- 贵宾: 1.475
- 金币: 8294.6
- 散金: 4158
- 红花: 39
- 沙发: 99
- 帖子: 21277
- 在线: 3169.3小时
- 虫号: 482065
- 注册: 2007-12-20
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
- 管辖: 微生物
★ ★ ★ ★
plantst5928(金币+1,VIP+0): 10-10 22:26
amisking(金币+3,VIP+0): 10-11 08:18
plantst5928(金币+1,VIP+0): 10-10 22:26
amisking(金币+3,VIP+0): 10-11 08:18
|
实验有时候就是要试试才知道的。 偶觉得你加的a尾存在问题，是不是没加上？ primer star 是不加A尾的酶吗？你用LA扩也一样啊，即保证保真性，又加了a尾，5kb的片段是有点长了，不过你要是想做后续实验，最终要测序验证的。 如果条带亮度和marker差不多的，我一般做4个： 10ul： 产物：T-------1:1, 1:2, 2：1， 2：2， 酶0.5，buf1，其他补水 最后混在一起，转化两管，基本没大问题 lz是在没辙了，不妨试试此拙见。 |
10楼2009-10-08 23:18:42
