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求助大片段载体构建
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我最近在将一个4700bp的基因连进T载体中，可是一直没有成功，现在已经做了3次了。大家有没有什么好的方法可以改进连接效率？ 我的步骤如下： 基因4700bp，用primer star扩增之后，切胶回收目的条带，回收效率还行（取回收产物1ul做模板pcr能扩增出目的条带来），之后加A（8ul底物，30min），连进T载体（promega的），一般4度连接过夜，转化，蓝白斑筛选。第二天板子上能看见白斑，但是挑斑，pcr验证却总是假阳性，提质粒验证，分子量是2500bp左右，肯定是T载体自连了。但是那些白斑是什么啊？ 现在做了3次都是这样，就是连不进去。快郁闷死了，大家有什么好的建议？多谢了!!! |
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4.7k的不算大，连应该没问题的。 你的a尾加的有问题吗，一般的酶都可以吧，都是pcr的时候加上的。 酶连4-16°都可以的，这个没问题。8h以上都可以。 关于白斑的这个，大家都遇到过，理论上自联应该是蓝斑，但是好多时候是白的。个人认为其可能连上了一些很小的片段，<100bp。你可以随机拿几个去测序看看，验证自己的想法。看看到底是空的还是连上了什么东西。 至于重复的，你做的时候可以多做几个，t量不变，片段有差别，做几个，总有一个可以的。 祝实验成功！ |
2楼2009-10-08 15:32:11
amisking
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实验有时候就是要试试才知道的。 偶觉得你加的a尾存在问题，是不是没加上？ primer star 是不加A尾的酶吗？你用LA扩也一样啊，即保证保真性，又加了a尾，5kb的片段是有点长了，不过你要是想做后续实验，最终要测序验证的。 如果条带亮度和marker差不多的，我一般做4个： 10ul： 产物：T-------1:1, 1:2, 2：1， 2：2， 酶0.5，buf1，其他补水 最后混在一起，转化两管，基本没大问题 lz是在没辙了，不妨试试此拙见。 |
10楼2009-10-08 23:18:42
