| 查看: 1161 | 回复: 13 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
求助大片段载体构建
|
|||
|
我最近在将一个4700bp的基因连进T载体中，可是一直没有成功，现在已经做了3次了。大家有没有什么好的方法可以改进连接效率？ 我的步骤如下： 基因4700bp，用primer star扩增之后，切胶回收目的条带，回收效率还行（取回收产物1ul做模板pcr能扩增出目的条带来），之后加A（8ul底物，30min），连进T载体（promega的），一般4度连接过夜，转化，蓝白斑筛选。第二天板子上能看见白斑，但是挑斑，pcr验证却总是假阳性，提质粒验证，分子量是2500bp左右，肯定是T载体自连了。但是那些白斑是什么啊？ 现在做了3次都是这样，就是连不进去。快郁闷死了，大家有什么好的建议？多谢了!!! |
回复此楼» 猜你喜欢
284求调剂
已经有10人回复
-
一志愿山东大学药学学硕求调剂
已经有4人回复
-
07化学280分求调剂
已经有4人回复
-
298-一志愿中国农业大学-求调剂
已经有12人回复
-
求材料，环境专业调剂
已经有3人回复
-
335求调剂
已经有5人回复
-
求调剂
已经有7人回复
-
一志愿吉大化学322求调剂
已经有4人回复
-
环境学硕288求调剂
已经有8人回复
-
341求调剂(一志愿湖南大学070300)
已经有6人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
9楼2009-10-08 23:03:22
scelab
荣誉版主 (文坛精英)
小木虫之有关部门负责人
- 应助: 63 (初中生)
- 贵宾: 1.475
- 金币: 8294.6
- 散金: 4158
- 红花: 39
- 沙发: 99
- 帖子: 21277
- 在线: 3169.3小时
- 虫号: 482065
- 注册: 2007-12-20
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
- 管辖: 微生物
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
plantst5928(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+6,VIP+0): 10-8 15:50
plantst5928(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+6,VIP+0): 10-8 15:50
|
4.7k的不算大，连应该没问题的。 你的a尾加的有问题吗，一般的酶都可以吧，都是pcr的时候加上的。 酶连4-16°都可以的，这个没问题。8h以上都可以。 关于白斑的这个，大家都遇到过，理论上自联应该是蓝斑，但是好多时候是白的。个人认为其可能连上了一些很小的片段，<100bp。你可以随机拿几个去测序看看，验证自己的想法。看看到底是空的还是连上了什么东西。 至于重复的，你做的时候可以多做几个，t量不变，片段有差别，做几个，总有一个可以的。 祝实验成功！ |
2楼2009-10-08 15:32:11
qgaoamtf
至尊木虫 (职业作家)
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 13397.4
- 散金: 1937
- 红花: 5
- 帖子: 4119
- 在线: 903.4小时
- 虫号: 447303
- 注册: 2007-10-31
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传育种学
4楼2009-10-08 16:01:24
5楼2009-10-08 16:57:56
