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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助大片段载体构建
汕头大学海洋科学接受调剂
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plantst5928

铜虫 (小有名气)

[交流] 求助大片段载体构建

我最近在将一个4700bp的基因连进T载体中，可是一直没有成功，现在已经做了3次了。大家有没有什么好的方法可以改进连接效率？
我的步骤如下：
基因4700bp，用primer star扩增之后，切胶回收目的条带，回收效率还行（取回收产物1ul做模板pcr能扩增出目的条带来），之后加A（8ul底物，30min），连进T载体（promega的），一般4度连接过夜，转化，蓝白斑筛选。第二天板子上能看见白斑，但是挑斑，pcr验证却总是假阳性，提质粒验证，分子量是2500bp左右，肯定是T载体自连了。但是那些白斑是什么啊？
现在做了3次都是这样，就是连不进去。快郁闷死了，大家有什么好的建议？多谢了!!!
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1楼 2009-10-08 15:15:38
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★ ★ ★ ★
plantst5928(金币+1,VIP+0): 10-10 22:26
amisking(金币+3,VIP+0): 10-11 08:18
实验有时候就是要试试才知道的。
偶觉得你加的a尾存在问题，是不是没加上？
primer star 是不加A尾的酶吗？你用LA扩也一样啊，即保证保真性，又加了a尾，5kb的片段是有点长了，不过你要是想做后续实验，最终要测序验证的。
如果条带亮度和marker差不多的，我一般做4个：
10ul：
产物：T-------1:1,   1:2,   2：1，   2：2，
酶0.5，buf1，其他补水
最后混在一起，转化两管，基本没大问题
lz是在没辙了，不妨试试此拙见。
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小木虫之有关部门负责人
10楼2009-10-08 23:18:42
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
plantst5928(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+6,VIP+0): 10-8 15:50
4.7k的不算大，连应该没问题的。
你的a尾加的有问题吗，一般的酶都可以吧，都是pcr的时候加上的。
酶连4-16°都可以的，这个没问题。8h以上都可以。

关于白斑的这个，大家都遇到过，理论上自联应该是蓝斑，但是好多时候是白的。个人认为其可能连上了一些很小的片段，<100bp。你可以随机拿几个去测序看看，验证自己的想法。看看到底是空的还是连上了什么东西。
至于重复的，你做的时候可以多做几个，t量不变，片段有差别，做几个，总有一个可以的。
祝实验成功！
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小木虫之有关部门负责人
2楼2009-10-08 15:32:11
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qgaoamtf

至尊木虫 (职业作家)
★
plantst5928(金币+1):谢谢参与
挑几个蓝斑的检测一下。白斑有可能在载体自联时A/T末端引起的移码突变造成的。
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4楼2009-10-08 16:01:24
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
plantst5928(金币+1):谢谢参与
不要加A，换个平端载体连接吧
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5楼2009-10-08 16:57:56
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