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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助大片段载体构建
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2009-10-8 23:18:
实验有时候就是要试试才知道的。
偶觉得你加的a尾存在问题，是不是没加上？
primer star 是不加A尾的酶吗？你用LA扩也一样啊，即保证保真性，又加了a尾，5kb的片段是有点长了，不过你要是想做后续实验，最终要测 ...

连的时候单独连，转化之前混起来，然后再转化
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小木虫之有关部门负责人
11楼2009-10-08 23:20:48
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
你说的LA是什么酶？我没用过，我一般都是先用primer star 把基因扩出来，然后把切角回收的产物再用ex taq去加A的。你用的LA可以把基因扩出来的同时加A 吗？
还有你说的连接比例的问题，我的连接体系是10ul，T载体是0.5ul，目的片段是7.5ul,酶一般0.5ul，5*buffer是2ul.不知您有什么建议？？谢谢指点.
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12楼2009-10-10 22:30:52
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 10-11 08:18
背单词中，不经常上网了
LA TAQ 酶，TAKARA公司卖的，pcr结束后会加a的
你可以网搜下说明书。
7.5ul的片段有点多了吧，2-4差不多，酶和buf没问题。
多做几个片段的梯度，会好点。
我认为主要问题是加A那步，从没试过这样加a的做法，没经验~
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小木虫之有关部门负责人
13楼2009-10-10 23:47:53
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bioxixi

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
plantst5928(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+3,VIP+0): 10-11 08:18
首先要保证你的PCR产物末端加a了啊，4700的片段，很可能用的高保真的酶？有的高保真酶是不加a的，首先确认这个吧
然后就连接是PCR产物和载体的浓度比，因为你这个片段很大，好像都比T载体大了吧，加入的量就不能和其他小片段一样了，因为浓度是会影响连接效率的，如果不好把握，可以做几个不同梯度
蓝白斑有时候会有假阳性的，从培养箱拿出来后可以再4度冰箱放几个小时，一些白斑会变蓝的。。。
再试试？祝好运
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14楼2009-10-11 08:15:55
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