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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 遇到大难题~~~
汕头大学海洋科学接受调剂
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

[交流] 遇到大难题~~~

本人现在从基因组上P一个基因，最初摸索的退火温度为58度，后来做大PCR体系，回收连T载体，筛选菌落做菌落PCR,同时还做了单引物验证，电泳结果显示：只添加了下游引物的PCR跟添加了上下游引物的PCR结果一样，均得到了一样大小的目的片段。。。
    于是老师让我继续优化PCR体系与条件，昨天做了个梯度PCR，做了5个梯度，退火温度分别为55、56、57、58、59，电泳后结果发现55、56有条带，而57~59均没有。。。。。现在都不知道怎么做，还有，我的PCR结果非特异性条带很多。。。。  
附上图片以说明问题，等待高手的指引。。。。
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1楼 2009-09-29 09:06:40
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
对图说明下：这个是梯度PCR的结果，从右至左分别为：MARKER，退火温度为55度的PCR结果，56度的PCR结果，57度的PCR结果，58度的PCR结果，59度的PCR结果
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2楼2009-09-29 09:10:08
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
MARKER从下至上分别为300bp、500bp、800bp、1000bp、1500bp、2000bp、3000bp、5000bp，我的目的条带为2000bp左右。。。。
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3楼2009-09-29 09:11:27
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huanshi

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 9-30 12:46
非特异性条带多可以考虑降落式PCR，不过你的退火温度较高后没有目的条带，所以估计也不行。。

建议：重新设计引物。。

[ Last edited by huanshi on 2009-9-29 at 09:42 ]
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4楼2009-09-29 09:40:55
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
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回收目的片段大小区域附近的条带，做巢市PCR
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5楼2009-09-29 10:16:00
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
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pcr特异性这么差，不知道你模板基因组DNA的完整性怎么样？模板的用量如何？
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Thank-you，so-blue.
6楼2009-09-29 13:58:35
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wlwhappy

银虫 (正式写手)
★
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要扩出2000bp那条带，建议你再稍微降低点退火温度，并在体系中加入少量DMSO！
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7楼2009-09-29 14:34:03
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-9-29 13:58:
pcr特异性这么差，不知道你模板基因组DNA的完整性怎么样？模板的用量如何？

我提取的基因组如图，模板是稀释了10倍的DNA。。。。
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8楼2009-09-29 16:21:03
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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引物一定要重新设计……
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9楼2009-09-29 16:27:08
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2009-9-29 16:27:
引物一定要重新设计……

这样啊，可是我设计这个引物的时候都已经找的最优的了。。。。我是从基因组上P目的基因的5'端作为同源重组的一个同源臂~~~~~~~~~~
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10楼2009-09-29 16:48:43
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