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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 9-30 12:47
我觉得你55和56度P出来的目的条带也是不可信的,因为杂带太多且你的目的片段的不是很亮。其实你做梯度PCR从55-59结果不会有很大的差别的。你的同源臂有多长,也可能是模板浓度太高了。不知道你100的PCR体系加了多少?
11楼2009-09-30 12:43:22
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

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Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-9-30 12:43:
我觉得你55和56度P出来的目的条带也是不可信的,因为杂带太多且你的目的片段的不是很亮。其实你做梯度PCR从55-59结果不会有很大的差别的。你的同源臂有多长,也可能是模板浓度太高了。不知道你100的PCR体系加了多 ...

我的同源臂设计的是2KB,我做的PCR体系是15ul的,模板加的是稀释了10倍的基因组DNA。。
   今天做了了个稀释10倍、50倍、100倍、150倍、500倍,结果发现稀释了50倍跟100倍的电泳结果中非特异性条带明显减少了,但是稀释了10倍的电泳结果非特异性条带也少了,这个明显跟我之前做的有很大的不同。。。
  唉,PCR这东西就这么不稳定这么难说明问题吗???
12楼2009-09-30 14:21:16
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
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Originally posted by 雨后郁金香 at 2009-9-30 14:21:

  我的同源臂设计的是2KB,我做的PCR体系是15ul的,模板加的是稀释了10倍的基因组DNA。。
   今天做了了个稀释10倍、50倍、100倍、150倍、500倍,结果发现稀释了50倍跟100倍的电泳结果中非特异性条带明显减少了 ...

同源臂是2kb?我觉得同源臂一般也就是十几到几十个bp吧,写错了吧?我问的就是你这15ul的体系中加的稀释后的模板体积是多少。PCR是会出现一些想不到的情况的,但是做多了、有些经验了就好了。
13楼2009-09-30 15:04:31
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-9-30 15:04:


同源臂是2kb?我觉得同源臂一般也就是十几到几十个bp吧,写错了吧?我问的就是你这15ul的体系中加的稀释后的模板体积是多少。PCR是会出现一些想不到的情况的,但是做多了、有些经验了就好了。

恩,没有写错啊,我要的就是这么大的同源臂啊,加的是1ul。。。嘿嘿,谢谢你对我问题的友情指导~~~
14楼2009-09-30 15:58:18
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caicaiyy

铜虫 (小有名气)


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有可能有外源DNA污染,因为下面那些杂带都有相同的有规律的带。
15楼2009-10-08 11:00:43
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caicaiyy

铜虫 (小有名气)

建议用水代替DNA做下对照!
16楼2009-10-08 11:01:41
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by caicaiyy at 2009-10-8 11:01:
建议用水代替DNA做下对照!

用水做了一次对照,不能说很干净,感觉还是依稀可以看见我的条带哦~~~
17楼2009-10-08 11:18:03
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franciszjm

金虫 (初入文坛)


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amisking(金币+0,VIP+0):别人都说过了你还说! 10-8 18:42
肯定模版有问题 或者引物不对 从设计一个看看!
18楼2009-10-08 12:53:10
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人

★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+4,VIP+0): 10-8 18:42
你说引物设计已经最佳了,那这个没发改了,建议看看会不会是引物相互为模板的结果。
DNA建议重新提,保证不污染,而且你加的量太多了。一般的体系在50ul吧,我一般不做100的,那样不大好,大不了做两管,最后在混起来用吗。
你做同源重组,不知道是细菌还是真菌,细菌500bp就可以了啊,我做过3次基因敲除,都没问题的。
如果最后还是扩到n多杂带,建议连一下,去测个序吧,大不了花几十块钱,现在测序便宜的很。
小木虫之有关部门负责人
19楼2009-10-08 13:00:20
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
说到退火温度这个,我都68度退火的,改善下条件,总能办到的。
扩2k的同源臂,哦,有点大噢。你能说说你重组什么吗?失活还是敲除?
小木虫之有关部门负责人
20楼2009-10-08 13:06:50
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