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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 遇到大难题~~~
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 9-30 12:47
我觉得你55和56度P出来的目的条带也是不可信的，因为杂带太多且你的目的片段的不是很亮。其实你做梯度PCR从55-59结果不会有很大的差别的。你的同源臂有多长，也可能是模板浓度太高了。不知道你100的PCR体系加了多少？
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11楼2009-09-30 12:43:22
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-9-30 12:43:
我觉得你55和56度P出来的目的条带也是不可信的，因为杂带太多且你的目的片段的不是很亮。其实你做梯度PCR从55-59结果不会有很大的差别的。你的同源臂有多长，也可能是模板浓度太高了。不知道你100的PCR体系加了多 ...

我的同源臂设计的是2KB，我做的PCR体系是15ul的，模板加的是稀释了10倍的基因组DNA。。
   今天做了了个稀释10倍、50倍、100倍、150倍、500倍，结果发现稀释了50倍跟100倍的电泳结果中非特异性条带明显减少了，但是稀释了10倍的电泳结果非特异性条带也少了，这个明显跟我之前做的有很大的不同。。。
  唉，PCR这东西就这么不稳定这么难说明问题吗？？？
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12楼2009-09-30 14:21:16
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
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Originally posted by 雨后郁金香 at 2009-9-30 14:21:

  我的同源臂设计的是2KB，我做的PCR体系是15ul的，模板加的是稀释了10倍的基因组DNA。。
   今天做了了个稀释10倍、50倍、100倍、150倍、500倍，结果发现稀释了50倍跟100倍的电泳结果中非特异性条带明显减少了 ...

同源臂是2kb？我觉得同源臂一般也就是十几到几十个bp吧，写错了吧？我问的就是你这15ul的体系中加的稀释后的模板体积是多少。PCR是会出现一些想不到的情况的，但是做多了、有些经验了就好了。
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13楼2009-09-30 15:04:31
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-9-30 15:04:


同源臂是2kb？我觉得同源臂一般也就是十几到几十个bp吧，写错了吧？我问的就是你这15ul的体系中加的稀释后的模板体积是多少。PCR是会出现一些想不到的情况的，但是做多了、有些经验了就好了。

恩，没有写错啊，我要的就是这么大的同源臂啊，加的是1ul。。。嘿嘿，谢谢你对我问题的友情指导~~~
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14楼2009-09-30 15:58:18
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caicaiyy

铜虫 (小有名气)
★
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有可能有外源DNA污染，因为下面那些杂带都有相同的有规律的带。
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15楼2009-10-08 11:00:43
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caicaiyy

铜虫 (小有名气)
建议用水代替DNA做下对照！
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16楼2009-10-08 11:01:41
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by caicaiyy at 2009-10-8 11:01:
建议用水代替DNA做下对照！

用水做了一次对照，不能说很干净，感觉还是依稀可以看见我的条带哦~~~
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17楼2009-10-08 11:18:03
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franciszjm

金虫 (初入文坛)
★
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amisking(金币+0,VIP+0):别人都说过了你还说！ 10-8 18:42
肯定模版有问题 或者引物不对 从设计一个看看！
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18楼2009-10-08 12:53:10
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+4,VIP+0): 10-8 18:42
你说引物设计已经最佳了，那这个没发改了，建议看看会不会是引物相互为模板的结果。
DNA建议重新提，保证不污染，而且你加的量太多了。一般的体系在50ul吧，我一般不做100的，那样不大好，大不了做两管，最后在混起来用吗。
你做同源重组，不知道是细菌还是真菌，细菌500bp就可以了啊，我做过3次基因敲除，都没问题的。
如果最后还是扩到n多杂带，建议连一下，去测个序吧，大不了花几十块钱，现在测序便宜的很。
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小木虫之有关部门负责人
19楼2009-10-08 13:00:20
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
说到退火温度这个，我都68度退火的，改善下条件，总能办到的。
扩2k的同源臂，哦，有点大噢。你能说说你重组什么吗？失活还是敲除？
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小木虫之有关部门负责人
20楼2009-10-08 13:06:50
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